SIST ISO 6870:2002

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 6870:2002
01-november-2002
.UPD.YDOLWDWLYQRGRORþHYDQMH]HDUDOHQRQD
Animal feeding stuffs -- Qualitative determination of zearalenone
Aliments des animaux -- Dosage qualitatif de la zéaralénone
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 6870:2002
ICS:
65.120 Krmila Animal feeding stuffs
SIST ISO 6870:2002 en
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

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SIST ISO 6870:2002

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SIST ISO 6870:2002
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 6870
Second edition
2002-04-15
Animal feeding stuffs — Qualitative
determination of zearalenone
Aliments des animaux — Dosage qualitatif de la zéaralénone

Reference number
ISO 6870:2002(E)
©
ISO 2002

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SIST ISO 6870:2002
ISO 6870:2002(E)
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SIST ISO 6870:2002
ISO 6870:2002(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 6870 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee
SC 10, Animal feeding stuffs.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 6870:1985), of which it constitutes a minor revision.
The title has been changed to stress that the method is only qualitative and the scope now states that the method is
for screening purposes only. The temperature range in 3.8.2 has been corrected to 0 °C to 5 °C.
Annex A of this International Standard is for information only.
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SIST ISO 6870:2002
INTERNATIONAL STANDARD ISO 6870:2002(E)
Animal feeding stuffs — Qualitative determination of zearalenone
1 Scope
This International Standard specifies a qualitative method for the determination of zearalenone in animal feeding
stuffs and, in particular, in maize. This method is for screening purposes only.
The limit of determination of zearalenone is approximately 50µg/kg.
NOTE Although sorghum gives interfering fluorescent spots identical to those of zearalenone, the method is still applicable to this
feed because the R values are different after development of the chromatogram in the second direction. These spots are not
f
developed by the specified confirmation technique.
2 Principle
A test portion is extracted with a mixture of acetonitrile and potassium chloride solution, then filtered, and an aliquot
portion is defatted with isooctane, followed by purification in a mixture of acetonitrile, water and lead acetate in the
presence of diatomaceous earth. After filtration, an aliquot portion is extracted with chloroform which is subsequently
evaporated.
The dry extract is dissolved in a mixture of benzene and acetonitrile. Two-dimensional thin-layer chromatography is
performed on an aliquot portion of this solution. The zearalenone content is determined by visual measurement or by
measurement of the intensity of fluorescence of the spot under UV light by comparison with known quantities of
zearalenone applied to the same plate.
The identity of the zearalenone is confirmed using bis-diazotized benzidine reagent.
3Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade and distilled or demineralized water or water of equivalent purity.
3.1 Acetonitrile.
3.2 Isooctane.
3.3 Chloroform.
WARNING — Chloroform is a toxic substance. Avoid inhalation of and exposure to chloroform. Work in a
fumehood when handling the solvent and solutions thereof.
98+ 2
3.4 Benzene/acetonitrile, mixture, by volume.
WARNING — Benzene is toxic by inhalation and contact with skin and is highly flammable.
3.5 Developing solvents.
3.5.1 Toluene/ethyl acetate/formic acid, 6+ 3+ 1 mixture, by volume.
3.5.2 Chlorofom/ethanol, 95+ 5 mixture, by volume.
3.6 Potassium chloride, 40 g/lsolution.
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ISO 2002 – All rights reserved 1

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SIST ISO 6870:2002
ISO 6870:2002(E)
3.7 Lead acetate solution, prepared as follows.
Weigh 200 g of lead acetate into a 1 000 ml one-mark volumetric flask, add 3 ml of acetic acid, dilute to the mark with
water and mix.
3.8 Bis-diazotized benzidine reagent, prepared as follows.
WARNING — Benzidine is a carcinogen, and is toxic by inhalation, contact with the skin and ingestion.
3.8.1 Preparation of 5 g/l benzidine solution
Place 0,5 g of benzidine in a 100 ml flask containing 20 ml of water and 1,5 ml of hydrochloric acid and make up to
volume with water.
Keep this solution protected from light in a brown glass bottle.
3.8.2 Preparation of the reagent
◦
Cool equal volumes of the benzidine solution (3.8.1) and of a 100 g/l sodium nitrite solution to between 0 C and
◦
5 C.
Thoroughly mix the two solutions. The solution obtained is dark purple and turbid. Leave to attain room temperature
(yellow colour) before use.
Prepare this reagent just before use.
3.9 Diatomaceous earth (Celite 545), hydrochloric acid washed.
3.10 Nitrogen.
3.11 Zearalenone, standard solution of concentration 10µg/ml, in benzene.
Determine the absorption spectrum of the solution between 300 nm and 330 nm by means of a spectrometer, using
10 mm silica optical cells and using benzene as reference. Record the maximum absorbance, A, which is close to
317 nm.
Calculate the zearalenone concentration, in micrograms per millilitre, of the solution, by means of the formula
318×A× 1 000
6 060
where
318 is the molar mass of zearalenone;
6 060 is the molar extinction coefficient.
4 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
4.1 Grinder, suitable for preparing a product to pass completely through a sieve of aperture size 1mm.
4.2 Shaker, capable of producing about 100 oscillations per minute.
4.3 Filter papers, medium grade (a rapid grade filter paper gives a turbid solution; a slow grade filter paper will
become clogged).
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2 ISO 2002 – All rights reserved

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SIST ISO 6870:2002
ISO 6870:2002(E)
4.4 Rotary evaporator with round bottom flask.
4.5 Apparatus for thin-layer chromatography, i.e. apparatus required for the preparation of the plates (4.6) and
application of spots (capillary pipettes or microsyringes), a developing tank, and apparatus for spraying the reagent
(3.8) on the plates.
4.6 Glass plates for thin-layer chromatography, of dimensions 200 mm× 200 mm, prepared as follows (the
quantities indicated are sufficient for the preparation of five plates).
Weigh 30 g of silica gel G-HR into a conical flask, add 60 ml of water, stopper and mix thoroughly for 1 min. Spread
the slurry over the plates in such a way that a uniform layer of thickness 0,25 mm is obtained. Allow to dry in air and
store the plates in a desiccator. Activate the plates before use by placing them in an oven, maintained at
◦ ◦
110 C± 3C1 for h.
Commercially available prepared plates may be used if the results obtained are comparable to the results obtained
with plates prepared as specified in the previous paragraph.
4.7 Short wavelength UV lamp (wavelength 253 nm).
The intensity of irradiation shall be such as to clearly
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 6870
Deuxième édition
2002-04-15
Aliments des animaux — Dosage qualitatif
de la zéaralénone
Animal feeding stuffs — Qualitative determination of zearalenone

Numéro de référence
ISO 6870:2002(F)
©
ISO 2002

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ISO 6870:2002(F)
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Imprimé en Suisse
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ISO 6870:2002(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison
avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments de la présente Norme internationale peuvent faire l'objet
de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas
avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 6870 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 10, Aliments des animaux.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 6870:1985), dont elle constitue une révision
mineure. Le titre a été modifé pour souligner le fait que la méthode n’est que qualitative, et dans le domaine
d’application il est maintenant spécifié que la méthode ne sert qu’à des fins de détection. La plage des températures
indiquée en 3.8.2 a été rectifiée pour lire 0 °C à 5 °C.
L'annexe A de la présente Norme internationale est donnée uniquement à titre d'information.
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ISO 2002 – Tous droits réservés iii

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NORME INTERNATIONALE ISO 6870:2002(F)
Aliments des animaux — Dosage qualitatif de la zéaralénone
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode qualitative de dosage de la zéaralénone dans les aliments
des animaux et en particulier dans le maïs. Cette méthode ne sert qu'à des fins de détection.
La limite de détermination de la zéaralénone se situe aux environs de 50µg/kg.
NOTE Bien que le sorgho présente des taches parasites de fluorescence identiques à celles de la zéaralénone, la méthode est
applicable à cet aliment, car les valeurs de R sont différentes après le développement du chromatogramme dans la seconde
f
direction. Ces taches ne sont pas révélées par la technique de confirmation spécifiée.
2Principe
Extraction sur une prise d'essai par un mélange d'acétonitrile et de solution de chlorure de potassium. Filtration,
prélèvement d'une partie aliquote suivi d'une délipidation à l'iso-octane puis d'une purification dans un mélange
d'acétonitrile, d'eau et d'acétate de plomb en présence de terre de diatomées. Après filtration, prélèvement d'une
partie aliquote et extraction dans du chloroforme qui est ensuite évaporé.
Dissolution de l'extrait sec dans un mélange de benzène et d'acétonitrile et chromatographie bidimensionnelle sur
couche mince d'une partie aliquote de cette solution. Détermination de la teneur en zéaralénone par mesure visuelle
ou par mesure, à l'aide d'un fluorodensitomètre, de l'intensité de fluorescence de la tache examinée à la lumière UV,
par comparaison avec des quantités connues d'un étalon de zéaralénone placé sur la même plaque.
Confirmation de l'identité de la zéaralénone à l'aide d'un réactif à la benzidine bis-diazotée.
3Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l'eau distillée ou déminéralisée ou de l‘eau de
pureté équivalente.
3.1 Acétonitrile.
3.2 Iso-octane.
3.3 Chloroforme.
AVERTISSEMENT —Le chloroforme est une substance toxique. Éviter l’inhalation de chloroforme et
l’exposition au chloroforme. Travailler sous hotte ventilée lors de la manipulation du solvant ou de ses
solutions.
3.4 Mélange de benzène-acétonitrile, 98+ 2, en volume.
AVERTISSEMENT — Le benzène est une substance toxique par inhalation et contact avec la peau, et très
inflammable.
©
ISO 2002 – Tous droits réservés 1

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ISO 6870:2002(F)
3.5 Solvants de développement.
3.5.1 Mélange de toluène-acétate d'éthyle-acide formique, 6+ 3+ 1, en volume.
3.5.2 Mélange de chloroforme-éthanol, , 95+ 5en volume.
3.6 Chlorure de potassium, solution à .
40 g/l
3.7 Acétate de plomb, solution préparée comme suit.
Peser dans une fiole de 1 000 ml, 200 g d'acétate de plomb, ajouter 3 ml d'acide acétique, compléter au trait repère
avec de l'eau et homogénéiser.
3.8 Réactif à la benzidine bis-diazotée, préparé comme suit.
AVERTISSEMENT — La benzidine est une substance cancérogène très toxique par inhalation, contact avec
la peau et ingestion.
3.8.1 Préparation d'une solution de benzidine à 5 g/l
Mettre 0,5 g de benzidine dans une fiole de 100 ml contenant 20 ml d'eau et 1,5 ml d'acide chlorhydrique, puis
compléter avec de l'eau.
Conserver cette solution à l'abri de la lumière dans un flacon en verre inactinique.
3.8.2 Préparation du réactif
◦ ◦
Refroidir à une température comprise entre 0C5 et C des volumes égaux de la solution de benzidine (3.8.1) et
d'une solution de nitrite de sodium à .100 g/l
Mélanger avec soin les deux solutions. La solution obtenue est trouble et de couleur pourpre foncé. La laisser se
réchauffer à la température du laboratoire avant utilisation (solution de couleur jaune).
Préparer ce réactif extemporanément.
3.9 Terre de diatomées (Celite 545), lavée à l'acide chlorhydrique.
3.10 Azote.
3.11 Zéaralénone, solution étalon à 10µg/ml dans le benzène.
Déterminer le spectre d'absorption de la solution entre 300 nm et 330 nm, à l'aide d'un spectromètre, dans une cuve
en silice de 10 mm d'épaisseur, par rapport au benzène, et relever le maximum d'absorbance (A) qui est proche de
317 nm.
Calculer la concentration en zéaralénone, en microgrammes par millitre, de la solution, à l'aide de la formule
suivante:
318×A× 1 000
6 060
où
318 est la masse molaire de la zéaralénone;
6 060 est le coefficient d'extinction molaire.
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ISO 6870:2002(F)
4 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
4.1 Broyeur, permettant d'obtenir un produit qui passe en totalité au travers d'un tamis de 1mm d'ouverture de
maille.
4.2 Agitateur, permettant d'obtenir environ 100 oscillations par minute.
4.3 Papier-filtre, à filtration moyenne (un papier à filtration rapide donne une solution trouble, et un papier à
filtration lente entraîne des colmatages).
4.4 Appareil rotatif à évaporation sous pression réduite avec ballon à fond rond.
4.5 Appareillage pour chromatographie sur couche mince, à savoir matériel nécessaire à la préparation des
plaques (4.6) et au dépôt des taches (pipettes capillaires ou microseringues), cuve de développement et appareil
pour pulvériser le réactif (3.8) sur les plaques.
4.6 Plaques de verre pour chromatographie sur couche mince, de dimensions 200 mm× 200 mm, préparées
comme suit (les quantités indiquées conviennent pour la préparation de cinq plaques).
Introduire 30 g de gel de silice G-HR dans une fiole conique, ajouter 60 ml d'eau, boucher et agiter pendant 1 min.
Étendre la suspension sur les plaques de manière à obtenir une couche uniforme de 0,25 mm d'épaisseur. Laisser
sécher à l'air et conserver ensuite les plaques dans un dessiccateur. Au moment de l'emploi, activer les plaques en
◦ ◦
les maintenant durant 1h dans l'étuve réglée à .110 C± 3 C
Les plaques prêtes à l'emploi conviennent dans la mesure où elles donnent des résultats semblables à ceux obtenus
avec des plaques préparées comme indiqué ci-dessus.
4.7 Lampe UV à ondes courtes (longueur d'onde 253 nm).
L'intensité d'irradiation doit permettre de distinguer encore nettement une tache de 25 ng de zéaralénone sur une
plaque pour chromatographie sur couche mince, à une distance de 100 mm de la lampe.
AVERTISSEMENT — La lumière UV étant dangereu
...