SIST ISO 8981:1997

INTERNATIONAL IS0
STANDARD
8981
First edition
1993-l -l-l 5
Identification of varieties by
Wheat -
electrophoresis
B/b - Identification des varibks par Blectrophor&e
Reference number
IS0 8981 :I 993(E)

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IS0 8981:1993(E)
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (IS0 member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through IS0
technical committees. Each member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. IS0
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(I EC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard IS0 8981 was prepared by Technical Committee
lSO/TC 34, Agricultural food products, Sub-Committee SC 4, Cereals and
pulses.
Annex A forms an inte gral part of this International Standard. Annex B is
for information only.
0 IS0 1993
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or utilized in any form or
by any means electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without per-
mission in writing from the publisher.
lnternationa I Organization for Standardization
Case Postal e 56 l W-1 211 Geneve 20 l Switzerland
Printed in Switzerland
ii

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IS0 8981:1993(E)
Introduction
The protein composition of wheat results from direct genetic control and
in general is not affected by environmental conditions (e.g. location or year
of growth). In addition, because wheat is essentially a self-pollinating plant,
the protein composition of the different varieties of wheat remains stable
for several plant generations. Therefore, the protein composition of a
wheat can be used to characterize and thus to identify its variety.
Protein profiles can be obtained by carrying out polyacrylamide gel
electrophoresis (PAGE) separations of the wheat gliadins. The poly-
acrylamide gels are stained to make the separated protein components
visible. If such protein profiles are established for all wheat varieties which
can be expected to occur in a particular region (i.e. a variety catalogue is
prepared), the identification of an unknown variety of wheat can be es-
tablished by reference to such a catalogue. Such a practice has been
thoroughly characterized and is in common use in numerous countries.
. . .
III

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This page intentionally left blank

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INTERNATIONAL STANDARD IS0 8981:1993(E)
- Identification of varieties by electrophoresis
Wheat
3.4 Acrylamide, 60,O g/l gel solution.
1 Scope
WARNING - Acrylamide monomer is a
This International Standard specifies a method for the
neurotoxic substance which can be absorbed
identification of the variety of a given lot of soft or
through the skin. Caution should be taken when
hard wheat, in the form of individual ground kernels,
handling either the crystalline powder or the gel
flour farina or semolina, by the separation of gliadin
solution.
proteins.
Dissolve, in a 100 ml one-mark volumetric flask,
6,0 g of acrylamide (electrophoresis grade), 0,300 g
2 Principle
of A/,/V-methylene bisacrylamide (electrophoresis
grade) and 0,020 g of ascorbic acid in the buffer sol-
The separation of gliadin wheat proteins by poly-
ution (3.2).
acrylamide gel electrophoresis (PAGE) in slab gels
containing aluminium lactate buffer, pH 3,l.
Make up to the mark with the buffer solution.
Store at 4 “C.
3 Reagents
3.5 Initiator solution, iron( I I) sulfate heptahydrate,
Use only reagents of recognized analytical grade un-
10 g/l solution.
less otherwise specified. The water used shall be
deionized water having a resistance greater than
Dissolve, in a 10 ml one-mark volumetric flask, 0,l g
10 MQ.
of iron sulfate heptahydrate in water and make up
to the mark with water.
3.1 Extraction solution, ethanol, 70 % (VW).
Prepare this solution shortly before use.
Dilute 700 ml of ethanol (absolute) with 300 ml of
water. 3.6 Catalyst solution, hydrogen peroxide,
0,99 % (m/m) solution.
3.2 Buffer solution, aluminium lactate, 2,5 g/l sol-
Dissolve, in a 10 ml one-mark volumetric flask,
ution.
0,33 ml of hydrogen peroxide [30 % (m/m)] in water.
Dissolve 15,O g of aluminium lactate in 5,5 litre of
Make up to the mark with water.
water. Adjust the pH to 3,l with lactic acid. Make up
to 6 litre with water. Vacuum filter through a filter of Prepare a fresh solution daily and store at 4 “C.
pore size 0,45 lrn.
3.7 Trichloroacetic acid, 9,6 % (m/m) solution.
Store at 4 “C.
Dissolve, in a 1 000 ml one-mark volumetric flask,
NOTE 1 The conductivity of the solution should be ap-
96 g of trichloroacetic acid in water.
proximately 950 pS/m.
Make up to the mark with water.
3.3 Sample dilution buffer
3.8 Brilliant blue R250, 5,0 g/l stock solution.
Dissolve 60,O g of sucrose in 50 ml of buffer solution
Dissolve 5,0 g of Brilliant blue in 1 litre of ethanol, stir
(3.2).
for 1 h, and then filter through a filter paper (4.10) to
Store at 4 “C. remove any inorganic salts present
1

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IS0 8981:1993(E)
3.9 Staining solution: Brilliant blue, 0,25 g/l sol- 4.14 Sample tubes, with caps.
ution.
4.15 Micropipettes
Mix 5,0 ml of stock solution (3.8) with 95 ml of
trichloroacetic acid solution (3.7).
Hand-held repeater pipettes with 2,5 ml disposable
tips to deliver volumes of 50 ~1 to 250 u.1. Adjustable
3.10 Marker or tracking dye, e.g. Pyronin G,
micropipettes to deliver 10 ~1 to 100 ~1 and 100 ~1 to
Methyl green.
1 000 PI.
4 Apparatus
4.16 Microcentrifuge, with minimum centrifugal
force of 10 000 g.
Usual laboratory apparatus and, in particular, the fol-
lowing.
4.17 Centrifuge tubes, of capacity I,5 ml to
2,0 ml.
4.1 Vertical electrophoresis unit’)
4.18 Vortex stirrer
4.2 Slot-formers, appropriate for the equipment
used.
4.19 Microsyringes, of capacity 25 ~1.
4.3 Power supply
4.20 Rigid polyethylene containers, approximately
A d.c. power supply which provides stable and con-
6 cm A 17 cm x 17 cm.
stant voltages up to 1 000 V and constant current up
to 300 mA (300 W min.).
4.21 Pyrex glass trays, 33 cm x 23 cm x 5 cm, for
gel washing, viewing and photography.
4.4 Cooling bath, thermoregulated.
A circulating water bath to maintain the electro-
4.22 Variable-speed shaker, capable of a shaking
phoresis unit at 20 “C + 1 “C.
speed of approx. 50 rpm.
4.5 Water purification system
4.23 Light box, equipped with a fluorescent light
A deionization system to provide high quality water
source and a minimum viewing surface area of
having a resistance greater than 10 Ma.
30 cm x 60 cm for gel examination and photography.
4.6 Analytical balance
4.24 Camera
Single-lens reflex 35 mm camera, loaded with fine-
4.7 pH-meter, with an accuracy of 0,05 pH units.
grain black and white or colour film.
4.8 Conductivity meter (optional).
4.25 Camera stand
4.9 Vacuum filter unit, with cellulose nitrate filters,
Any stable stand for photography with a camera using
pore size 0,45 pm.
slow shutter speeds.
4.10 Filter paper, Whatman No. 1, 15,O cm.
5 Sampling
4.11 Magnetic stirrer, with PTFE-coated21 stirring
It is important that the laboratory receive a sample
bars, 2,5 cm and 5 cm long.
which is truly representative and has not been dam-
aged or changed during transport or storage.
4.12 Hammer and steel plate, for crushing individ-
ual kernels.
Sampling is not part of the method specified in this
International Standard. Recommended sampling
4.13 Sample grinder, capable of yielding a particle methods are given in IS0 950, IS0 2170 and
size of 500 Km. IS0 6644.
1) Numerous commercial vertical electrophoresis units are available.
2) PTFE = polytetrafluoroethylene
2

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IS0 8981:1993(E)
6.2 Preparation of standard extract
6 Procedure
Proceed as described in 6.1 but use kernels of the
pure reference variety (Neepawa)?
6.1 Preparation of test samples and
6.3 Preparation of gels
extraction
Assemble gel cassettes with 1,5 mm-thick spacers,
as described in the manufacturer’s instructions.
6.1.1 Single kernel samples
NOTE 4 To aid in pouring the gel solution and inserting
NOTE 2 The number of individual seeds which need to
the slot-former into the cassette, tape a piece of plastic (e.g.
be analysed depends on the accuracy of determination re-
Plexiglas? 140 mm x 25 mm x 3 mm) to the top edge of
quired. Confidence limits based on the examination of vari- one of the cassette glass plates.
ous numbers of kernels are listed in annex A. Analysis of
larger sub-samples yields proportion estimates of greater
To prepare each gel, combine 30 g of gel solution
accuracy.
(3.4) and 75 ~1 of initiator solution (3.5) in a 125 ml
filtering flask with a side arm. Degas the solution un-
Place the kernel between folded paper (5 cm x 5 cm)
der a vacuum of at least 50 mmHg for 2 min with
on a metal plate and pulverize with the hammer
constant mixing. Add 120 ~1 catalyst solution (3.6).
(4.12). Transfer the crushed material to the sample
Swirl the solution gently by hand for 10 s, taking care
tube (4.14). Add 200 ~1 of extraction solution (3.1) us-
not to incorporate air bubbles. Quickly pour the sol-
ing a repeater pipette (4.15). Mix the contents with
ution into the cassette in a continuous stream to
the vortex mixer (4.18) for 10 s and allow to stand at
minimize the introduction of air. Immediately after the
room temperature (20 “C) for at least 1 h. Add 100 ~1
cassette is filled, insert the slot-former (4.2).
of sample dilution buffer (3.3) and remix. Allow mix-
Polymerization is complete in 5 min to 10 min.
ture to settle for 10 min before sampling for analysis.
NOTE 5 A casting temperature of 20 “C to 22 “C has
If the kernel extract is to be kept for more than 24 h,
been found to give satisfactory results.
transfer extract into a centrifuge tube (4.17) and
centrifuge for 3 min at 10 000 g in the micro-
6.4 Sample loading
centrifuge (4.16). Decant the supernatant into a sam-
ple tube and replace the cap.
Carefully remove the slot-former and fill the sample
wells with buffer solution (3.2) to prevent dehydration
Store at 4 “C for up to 10 days.
of the gel. Using a microsyringe (4.19), deposit the
sample extract (6.1 .I or 6.1.2) in the bottom of the
NOTE 3 The volumes used are for an average weight of
wells. The amount of sample extract depends on the
30 mg. Generally, mo
...

NORME Iso
INTERNATIONALE
8981
Première édition
1993-I 1-l 5
I
- Identification des variétés par
Ble
électrophorèse
Wheat - Identification of varie ties b y electrophoresis
Numéro de référence
ISO 8981 :1993(F)

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ISO 8981:1993(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé a cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 8981 a été élaborée par le comité technique
ISODC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 4, C6réales et
légumineuses.
L’annexe A fait partie intégrante de la présente Norme internationale.
L’annexe B est donnée uniquement a titre d’information.
0 60 1993
Droits de reproduction réservk Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite
ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-1 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 8981:1993(F)
Introduction
La composition protéique du blé est directement contrôlée par les gènes
et généralement indépendante des conditions d’environnement (lieu et
année de croissance). Par ailleurs, dans le cas du blé, la fécondation s’ef-
fectue essentiellement par autopollinisation et la composition protéique
est donc stable sur plusieurs générations. Elle peut par conséquent servir
à la caractérisation et donc à l’identification variétale, à partir des dia-
grammes protéiques qui peuvent être obtenus en séparant les gliadines
par électrophorèse en gel de polyactylamide. La séparation est suivie
d’une coloration des gels qui permet de révéler les différents composants
protéiques, et les schémas protéiques obtenus sont rapportés aux diffé-
rentes variétés de blé. II convient de déterminer les schémas types de
toutes les variétés susceptibles d’être rencontrées dans une situation
donnée (établissement d’un catalogue variétal). La comparaison de
I’électrophorégramme obtenu pour une variété inconnue avec les schémas
types du catalogue permet l’identification variétale. Cette technique est
totalement définie et couramment utilisée dans de nombreux pays.

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Page blanche

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ISO 8981:1993(F)
NORME INTERNATIONALE
I
- Identification des variétés par électrophorèse
Ble
3.3 Tampon de dilution des échantillons
1 Domaine d’application
Dissoudre 60,O g de saccharose dans 50 ml de solu-
La présente Norme internationale prescrit une mé-
tion tampon (3.2).
thode d’identification de la variété d’un lot donné de
blé tendre ou de blé dur, sous la forme de grains
Conserver à 4 OC.
broyés pris isolément, de farine, fécule ou semoule,
par séparation des protéines de gliadine.
3.4 Acrylamide, solution a 60,O g/l de gel.
AVERTISSEMENT - Le monomere acrylamide est
2 Principe
une substance neurotoxique pouvant être absor-
bec par voie transcutanée. II convient de le mani-
Séparation des gliadines du blé par électrophorèse en
puler avec précaution, qu’il soit en poudre ou en
gel de polyacrylamide, dans des plaques de gel
solution.
contenant un tampon lactate d’aluminium de pH 3,l.
Dissoudre, dans une fiole jaugée de 100 ml, 6,0 g
d’acrylamide (qualité pour électrophorése), 0,300 g de
A/,/V-méthylène biactylamide (qualité pour électropho-
3 Réactifs
rése) et 0,020 g d’acide ascorbique dans la solution
tampon (3.2).
Sauf indications contraires, utiliser uniquement des
réactifs de qualité analytique reconnue. L’eau utilisée
Compléter au volume avec la solution tampon.
doit être de l’eau déionisée ayant une résistance su-
périeure a 10 Ma.
Conserver a 4 OC.
3.5 Solution d’initiation, solution de fer( II)
3.1 Solution d’extraction, éthanol, solution à
heptahydraté à 10 g/l
70 % (KW).
Dissoudre, dans une fiole jaugée de 10 ml, 0,l g de
Diluer 700 ml d’éthanol (absolu) avec 300 ml d’eau.
sulfate de fer(U) heptahydraté dans de l’eau et com-
pléter au volume avec de l’eau.
3.2 Solution tampon, lactate d’aluminium, solution
Préparer cette solution extemporanément.
à 2,5 g/l.
Dissoudre 150 g de lactate d’aluminium dans 3.6 Solution de catalyse, peroxyde d’hydrogène
5,5 litres d’eau. Ajuster le pH a 3,l avec de l’acide
solution a 0,99 % (m/m).
lactique. Compléter a 6 litres avec de l’eau. Filtrer
Dissoudre, dans une fiole jaugée de 10 ml, 0,33 ml
sous vide sur filtre de porosité 0,45 prn.
de peroxyde d’hydrogène [30 % (&Y)] dans de l’eau.
Conserver a 4 OC. Compléter au volume avec de l’eau.
Préparer une nouvelle solution chaque jour et conser-
La conductivité de la solution se situe approxi-
NOTE 1
mativement à 950 pS/m. ver a 4 OC.

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3.7 Acide trichloroacétique, solution à 4.10 Papier filtre, Whatman no 1, 15,0 cm.
9,6 % (dm).
4.11 Agitateur magnétique, avec barreaux magné-
Dissoudre, dans une fiole jaugée de 1 000 ml, 96 g
tiques revêtus de PTFE*), de 2,5 cm et 5 cm de lon-
d’acide trichloroacétique dans de l’eau.
gueur.
Compléter au volume avec de l’eau.
4.12 Marteau et plaque en acier, pour écraser les
3.8 Bleu brillant R250, solution met-e a 50 g/l. grains pris isolément.
Dissoudre 5,0 g de Bleu brillant dans 1 litre d’éthanol,
4.13 Broyeur d’échantillons, permettant d’obtenir
agiter pendant 1 h, puis filtrer sur papier filtre pour
des particules d’une taille de 500 prn.
éliminer toute trace de sels inorganiques.
4.14 Tubes à échantillons, avec capuchons.
3.9 Solution de coloration: Bleu brillant, solution
à 0,25 g/l.
4.15 Micropipettes
Mélanger 5,0 ml de solution mère (3.8) avec 95 ml de
solution d’acide trichloroacétique (3.7).
Pipettes automatiques avec cônes jetables de
2,5 ml, permettant de délivrer des volumes de 50 FI
à 250 11. Micropipettes à volume ajustable à 10 ~1 à
3.10 Marqueur ou traceur coloré, par exemple,
100 ~1 et 100 j.~l à 1 000 ~1.
pyronine G, vert de méthyle.
4.16 Microcentrifugeuse, pouvant produire une
4 Appareillage
force centrifuge de 10 000 g minimum.
Maté rie1 courant de laboratoire, et en particulier ce qui
suit.
4.17 Tubes à centrifuger, de capacité 1,5 ml à
2,0 ml.
4.1 Unité d’électrophorèse verticale’)
4.18 Homogénéiseur vortex
4.2 Peignes, appropriés a l’équipement utilisé.
4.19 Micro-seringues, de capacité 25 ~1.
4.3 Alimentation stabilisée
rigides en polyéthylène, de
4.20 Récipients
Générateur de courant continu pouvant délivrer des
6 cm x 17 cm x 17 cm approximativement.
tensions stables et constantes jusqu’à 1 000 V et une
intensité constante jusqu’à 300 mA (min. 300 W).
4.21 Bacs en pyrex, de 33 cm x 23 cm x 5 cm,
pour le lavage, l’observation et la photographie des
4.4 Bain de réfrigération, thermorégulé.
gels .
Bain d’eau circulant permettant le maintien à
20 “C & 1 “C de la cuve à électrophorèse.
4.22 Agitateur à vitesse variable, permettant de
fournir une vitesse d’agitation d’environ 50 rpm.
4.5 Système de purification de l’eau
4.23 Négatoscope, avec source de lumière fluores-
Système de déionisation produisant de l’eau de haute
cente, et surface utile de 30 cm x 60 cm minimum
pureté de résistance supérieure à 10 MQ.
pour l’examen et la photographie des gels.
4.6 Balance analytique
4.24 Appareil photographique
4.7 pH-mètre, permettant de mesurer le pH avec
Appareil type reflex mono-objectif de 35 mm, avec
une précision de + 0,05.
film noir et blanc ou de couleur à grain fin.
4.8 Conductimètre (facultatif).
4.25 Statif
4.9 Appareil de filtration sous vide, avec filtres en Tout pied stable permettant la prise de vues à faible
nitrocellulose, d’une porosité de 0,45 prn. vitesse d’obturation.
II existe de nombreux appareils d’électrophorèse verticale dans le commerce.
1)
PTFE = polytétrafluoroéthylène
2)
2

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ISO 8981:1993(F)
6.1.2 Échantillons en vrac
5 Échantillonnage
Moudre l’échantillon dans le broyeur électrique
II est important que le laboratoire reçoive un échan-
(4.13). Peser 0,2 g de la mouture dans un tube à
tillon réellement représentatif, non endommagé ou
centrifuger (4.17) et ajouter 600 ~1 de solution d’ex-
modifié lors du transfert et de l’entreposage.
traction. Homogénéiser pendant 10 s dans le vortex
(4.18) et laisser reposer à température ambiante
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode
(20 “C) pendant 1 h au moins, ou pendant toute une
spécifiée dans la présente Norme internationale. Des
nuit. Centrifuger pendant 5 min à 10 000 g.
méthodes d’échantillonnage recommandées sont
Transvaser 200 ~1 du surnageant dans un tube à
données dans I’ISO 950, I’ISO 2170 et I’ISO 6644.
échantillons contenant 400 ~1 de tampon de dilution
de l’échantillon (3.3) et fermer le tube. Homogénéiser
pendant 10 s.
6 Mode opératoire
Conserver à 4 “C pendant 10 jours maximum.
6.1 Préparation des échantillons pour essai
6.2 Préparation de référence
et extraction
Procéder comme décrit en 6.1, mais en utilisant des
6.1 .l Échantillons de graines isolées graines de la variété de référence pure (Neepawa)s.
NOTE 2 Le nombre de graines isolées a analyser, pour
6.3 Préparation du gel
une identification, dépend de la précision recherchée. Les
limites de l’intervalle de confiance, en fonction du nombre
Assembler les moules avec des intercalaires de
de grains examines, sont données dans l’annexe A. L’ana-
lyse de sous-échantillons d’effectifs plus élevés permet 1,5 mm d’épaisseur, conformément aux instructions
d’obtenir des estimations de proportion plus précises. du fabricant.
NOTE 4 Pour faciliter le coulage du gel et l’insertion du
Placer les grains dans une feuille de papier pliée
peigne, fixer, avec du papier adhésif, une bande de plasti-
(5 cm x 5 cm) sur une plaque métallique et les réduire
que (par exemple Plexiglas
41, 140 mm x 25 mm x 3 mm) au
en poudre avec le marteau (4.12). Transférer les
bord supérieur de l’une des plaques en verre de chaque
grains écrasés dans un tube à échantillons (4.14).
moule.
Ajouter 200 JJI de solution d’extraction (3.1) à l’aide du
distributeur (4.15), homogénéiser pendant 10 s dans
Pour préparer chaque gel, mélanger 30 g de solution
le vortex (4.18) puis laisser reposer à température
de gel (3.4) et 75 ~1 de solution d’initiation (3.5) dans
ambiante (20 OC) pendant 1 h au moins. Ajouter
une fiole à filtrer de 125 ml avec tubulure latérale.
100 FI du tampon de dilution de l’échantillon (3.3) et
Dégazer le mélange pendant 2 min sous pression in-
homogénéiser à nouveau. Laisser reposer le mélange
férieure ou égale à 50 mm Hg en mélangeant
pendant 10 min avant de prélever l’échantillon pour
constamment. Ajouter 120 ~1 de solution de catalyse
analyse.
(3.6). Homogénéiser manuellement la solution pen-
dant 10 s en la faisant tourner avec précaution pour
Si l’extrait des grains doit être conservé pendant plus
éviter la formation de bulles d’air. Verser rapidement
de 24 h, le transvaser dans un tube à centrifuger
la solution dans le moule en veillant à maintenir un
(4.17) et passer pendant 3 min dans la
écoulement continu de façon à réduire au minimum
microcentrifugeuse (4.16) à
...

NORME Iso
INTERNATIONALE
8981
Première édition
1993-I 1-l 5
I
- Identification des variétés par
Ble
électrophorèse
Wheat - Identification of varie ties b y electrophoresis
Numéro de référence
ISO 8981 :1993(F)

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ISO 8981:1993(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé a cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 8981 a été élaborée par le comité technique
ISODC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 4, C6réales et
légumineuses.
L’annexe A fait partie intégrante de la présente Norme internationale.
L’annexe B est donnée uniquement a titre d’information.
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Droits de reproduction réservk Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite
ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
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ISO 8981:1993(F)
Introduction
La composition protéique du blé est directement contrôlée par les gènes
et généralement indépendante des conditions d’environnement (lieu et
année de croissance). Par ailleurs, dans le cas du blé, la fécondation s’ef-
fectue essentiellement par autopollinisation et la composition protéique
est donc stable sur plusieurs générations. Elle peut par conséquent servir
à la caractérisation et donc à l’identification variétale, à partir des dia-
grammes protéiques qui peuvent être obtenus en séparant les gliadines
par électrophorèse en gel de polyactylamide. La séparation est suivie
d’une coloration des gels qui permet de révéler les différents composants
protéiques, et les schémas protéiques obtenus sont rapportés aux diffé-
rentes variétés de blé. II convient de déterminer les schémas types de
toutes les variétés susceptibles d’être rencontrées dans une situation
donnée (établissement d’un catalogue variétal). La comparaison de
I’électrophorégramme obtenu pour une variété inconnue avec les schémas
types du catalogue permet l’identification variétale. Cette technique est
totalement définie et couramment utilisée dans de nombreux pays.

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ISO 8981:1993(F)
NORME INTERNATIONALE
I
- Identification des variétés par électrophorèse
Ble
3.3 Tampon de dilution des échantillons
1 Domaine d’application
Dissoudre 60,O g de saccharose dans 50 ml de solu-
La présente Norme internationale prescrit une mé-
tion tampon (3.2).
thode d’identification de la variété d’un lot donné de
blé tendre ou de blé dur, sous la forme de grains
Conserver à 4 OC.
broyés pris isolément, de farine, fécule ou semoule,
par séparation des protéines de gliadine.
3.4 Acrylamide, solution a 60,O g/l de gel.
AVERTISSEMENT - Le monomere acrylamide est
2 Principe
une substance neurotoxique pouvant être absor-
bec par voie transcutanée. II convient de le mani-
Séparation des gliadines du blé par électrophorèse en
puler avec précaution, qu’il soit en poudre ou en
gel de polyacrylamide, dans des plaques de gel
solution.
contenant un tampon lactate d’aluminium de pH 3,l.
Dissoudre, dans une fiole jaugée de 100 ml, 6,0 g
d’acrylamide (qualité pour électrophorése), 0,300 g de
A/,/V-méthylène biactylamide (qualité pour électropho-
3 Réactifs
rése) et 0,020 g d’acide ascorbique dans la solution
tampon (3.2).
Sauf indications contraires, utiliser uniquement des
réactifs de qualité analytique reconnue. L’eau utilisée
Compléter au volume avec la solution tampon.
doit être de l’eau déionisée ayant une résistance su-
périeure a 10 Ma.
Conserver a 4 OC.
3.5 Solution d’initiation, solution de fer( II)
3.1 Solution d’extraction, éthanol, solution à
heptahydraté à 10 g/l
70 % (KW).
Dissoudre, dans une fiole jaugée de 10 ml, 0,l g de
Diluer 700 ml d’éthanol (absolu) avec 300 ml d’eau.
sulfate de fer(U) heptahydraté dans de l’eau et com-
pléter au volume avec de l’eau.
3.2 Solution tampon, lactate d’aluminium, solution
Préparer cette solution extemporanément.
à 2,5 g/l.
Dissoudre 150 g de lactate d’aluminium dans 3.6 Solution de catalyse, peroxyde d’hydrogène
5,5 litres d’eau. Ajuster le pH a 3,l avec de l’acide
solution a 0,99 % (m/m).
lactique. Compléter a 6 litres avec de l’eau. Filtrer
Dissoudre, dans une fiole jaugée de 10 ml, 0,33 ml
sous vide sur filtre de porosité 0,45 prn.
de peroxyde d’hydrogène [30 % (&Y)] dans de l’eau.
Conserver a 4 OC. Compléter au volume avec de l’eau.
Préparer une nouvelle solution chaque jour et conser-
La conductivité de la solution se situe approxi-
NOTE 1
mativement à 950 pS/m. ver a 4 OC.

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3.7 Acide trichloroacétique, solution à 4.10 Papier filtre, Whatman no 1, 15,0 cm.
9,6 % (dm).
4.11 Agitateur magnétique, avec barreaux magné-
Dissoudre, dans une fiole jaugée de 1 000 ml, 96 g
tiques revêtus de PTFE*), de 2,5 cm et 5 cm de lon-
d’acide trichloroacétique dans de l’eau.
gueur.
Compléter au volume avec de l’eau.
4.12 Marteau et plaque en acier, pour écraser les
3.8 Bleu brillant R250, solution met-e a 50 g/l. grains pris isolément.
Dissoudre 5,0 g de Bleu brillant dans 1 litre d’éthanol,
4.13 Broyeur d’échantillons, permettant d’obtenir
agiter pendant 1 h, puis filtrer sur papier filtre pour
des particules d’une taille de 500 prn.
éliminer toute trace de sels inorganiques.
4.14 Tubes à échantillons, avec capuchons.
3.9 Solution de coloration: Bleu brillant, solution
à 0,25 g/l.
4.15 Micropipettes
Mélanger 5,0 ml de solution mère (3.8) avec 95 ml de
solution d’acide trichloroacétique (3.7).
Pipettes automatiques avec cônes jetables de
2,5 ml, permettant de délivrer des volumes de 50 FI
à 250 11. Micropipettes à volume ajustable à 10 ~1 à
3.10 Marqueur ou traceur coloré, par exemple,
100 ~1 et 100 j.~l à 1 000 ~1.
pyronine G, vert de méthyle.
4.16 Microcentrifugeuse, pouvant produire une
4 Appareillage
force centrifuge de 10 000 g minimum.
Maté rie1 courant de laboratoire, et en particulier ce qui
suit.
4.17 Tubes à centrifuger, de capacité 1,5 ml à
2,0 ml.
4.1 Unité d’électrophorèse verticale’)
4.18 Homogénéiseur vortex
4.2 Peignes, appropriés a l’équipement utilisé.
4.19 Micro-seringues, de capacité 25 ~1.
4.3 Alimentation stabilisée
rigides en polyéthylène, de
4.20 Récipients
Générateur de courant continu pouvant délivrer des
6 cm x 17 cm x 17 cm approximativement.
tensions stables et constantes jusqu’à 1 000 V et une
intensité constante jusqu’à 300 mA (min. 300 W).
4.21 Bacs en pyrex, de 33 cm x 23 cm x 5 cm,
pour le lavage, l’observation et la photographie des
4.4 Bain de réfrigération, thermorégulé.
gels .
Bain d’eau circulant permettant le maintien à
20 “C & 1 “C de la cuve à électrophorèse.
4.22 Agitateur à vitesse variable, permettant de
fournir une vitesse d’agitation d’environ 50 rpm.
4.5 Système de purification de l’eau
4.23 Négatoscope, avec source de lumière fluores-
Système de déionisation produisant de l’eau de haute
cente, et surface utile de 30 cm x 60 cm minimum
pureté de résistance supérieure à 10 MQ.
pour l’examen et la photographie des gels.
4.6 Balance analytique
4.24 Appareil photographique
4.7 pH-mètre, permettant de mesurer le pH avec
Appareil type reflex mono-objectif de 35 mm, avec
une précision de + 0,05.
film noir et blanc ou de couleur à grain fin.
4.8 Conductimètre (facultatif).
4.25 Statif
4.9 Appareil de filtration sous vide, avec filtres en Tout pied stable permettant la prise de vues à faible
nitrocellulose, d’une porosité de 0,45 prn. vitesse d’obturation.
II existe de nombreux appareils d’électrophorèse verticale dans le commerce.
1)
PTFE = polytétrafluoroéthylène
2)
2

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ISO 8981:1993(F)
6.1.2 Échantillons en vrac
5 Échantillonnage
Moudre l’échantillon dans le broyeur électrique
II est important que le laboratoire reçoive un échan-
(4.13). Peser 0,2 g de la mouture dans un tube à
tillon réellement représentatif, non endommagé ou
centrifuger (4.17) et ajouter 600 ~1 de solution d’ex-
modifié lors du transfert et de l’entreposage.
traction. Homogénéiser pendant 10 s dans le vortex
(4.18) et laisser reposer à température ambiante
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode
(20 “C) pendant 1 h au moins, ou pendant toute une
spécifiée dans la présente Norme internationale. Des
nuit. Centrifuger pendant 5 min à 10 000 g.
méthodes d’échantillonnage recommandées sont
Transvaser 200 ~1 du surnageant dans un tube à
données dans I’ISO 950, I’ISO 2170 et I’ISO 6644.
échantillons contenant 400 ~1 de tampon de dilution
de l’échantillon (3.3) et fermer le tube. Homogénéiser
pendant 10 s.
6 Mode opératoire
Conserver à 4 “C pendant 10 jours maximum.
6.1 Préparation des échantillons pour essai
6.2 Préparation de référence
et extraction
Procéder comme décrit en 6.1, mais en utilisant des
6.1 .l Échantillons de graines isolées graines de la variété de référence pure (Neepawa)s.
NOTE 2 Le nombre de graines isolées a analyser, pour
6.3 Préparation du gel
une identification, dépend de la précision recherchée. Les
limites de l’intervalle de confiance, en fonction du nombre
Assembler les moules avec des intercalaires de
de grains examines, sont données dans l’annexe A. L’ana-
lyse de sous-échantillons d’effectifs plus élevés permet 1,5 mm d’épaisseur, conformément aux instructions
d’obtenir des estimations de proportion plus précises. du fabricant.
NOTE 4 Pour faciliter le coulage du gel et l’insertion du
Placer les grains dans une feuille de papier pliée
peigne, fixer, avec du papier adhésif, une bande de plasti-
(5 cm x 5 cm) sur une plaque métallique et les réduire
que (par exemple Plexiglas
41, 140 mm x 25 mm x 3 mm) au
en poudre avec le marteau (4.12). Transférer les
bord supérieur de l’une des plaques en verre de chaque
grains écrasés dans un tube à échantillons (4.14).
moule.
Ajouter 200 JJI de solution d’extraction (3.1) à l’aide du
distributeur (4.15), homogénéiser pendant 10 s dans
Pour préparer chaque gel, mélanger 30 g de solution
le vortex (4.18) puis laisser reposer à température
de gel (3.4) et 75 ~1 de solution d’initiation (3.5) dans
ambiante (20 OC) pendant 1 h au moins. Ajouter
une fiole à filtrer de 125 ml avec tubulure latérale.
100 FI du tampon de dilution de l’échantillon (3.3) et
Dégazer le mélange pendant 2 min sous pression in-
homogénéiser à nouveau. Laisser reposer le mélange
férieure ou égale à 50 mm Hg en mélangeant
pendant 10 min avant de prélever l’échantillon pour
constamment. Ajouter 120 ~1 de solution de catalyse
analyse.
(3.6). Homogénéiser manuellement la solution pen-
dant 10 s en la faisant tourner avec précaution pour
Si l’extrait des grains doit être conservé pendant plus
éviter la formation de bulles d’air. Verser rapidement
de 24 h, le transvaser dans un tube à centrifuger
la solution dans le moule en veillant à maintenir un
(4.17) et passer pendant 3 min dans la
écoulement continu de façon à réduire au minimum
microcentrifugeuse (4.16) à
...