SIST ISO 10708:1997

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 10708:1997
01-avgust-1997
.DNRYRVWYRGH9UHGQRWHQMHSRSROQHDHUREQHELRORãNHUD]JUDGOMLYRVWLRUJDQVNLK
VQRYLYYRGQHPRNROMX'RORþDQMHELRNHPLMVNHSRWUHEHSRNLVLNX]GYRID]QLP
SUHVNXVRPY]DSUWLKVWHNOHQLFDK
Water quality -- Evaluation in an aqueous medium of the ultimate aerobic
biodegradability of organic compounds -- Determination of biochemical oxygen demand
in a two-phase closed bottle test
Qualité de l'eau -- Évaluation en milieu aqueux de la biodégradabilité aérobie ultime des
composés organiques -- Détermination de la demande biochimique en oxygène en fiole
fermée à deux phases
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 10708:1997
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
SIST ISO 10708:1997 en
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

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SIST ISO 10708:1997

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SIST ISO 10708:1997
IS0
INTERNATIONAL
STANDARD 10708
First edition
1997-02-01
Evaluation in an aqueous
Water quality -
medium of the ultimate aerobic
biodegradability of organic compounds -
Determination of biochemical oxygen
demand in a two-phase closed bottle test
Qua/it6 de I’eau - gvaluation en milieu aqueux de la biodkgradabilit6
akrobie u/time des compos6s organiques - Dbtermination de la demande
biochimique en oxygkne en fiole ferm6e 2 deux phases
Reference number
IS0 10708: 1997(E)

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SIST ISO 10708:1997
IS0 10708:1997(E)
Contents
1
........................................................................................................................................................................
1 Scope
1
................................................................................................................................................
2 Normative reference
1
................................................................................................................................................................
3 Definitions
3
4 Principle .
3
.....................................................................................................................................................
5 Test environment
3
6 Reagents .
4
.................................................................................................................................................................
7 Apparatus
5
8 Procedure .
8
...................................................................................................................
9 Calculation and expression of results
10
IO Validity of the test .
10
............................................................................................................................................................
11 Test report
.................................................. 12
Calculation of the theoretical oxygen demand (ThOD)
Annex A (informative)
13
..................................................
Annex B (informative) Determination of the chemical oxygen demand (COD)
14
.....................................
Annex C (informative) Correction for oxygen uptake for interference by nitrification
....................................................................................... 16
Annex D (informative) Example of a degradation curve
17
.......................................................................................................................
Annex E (informative) Bibliography
0 IS0 1997
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case postale 56 l CH-1211 Geneve 20 l Switzerland
Internet central @ iso.ch
x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Printed in Switzerland
ii

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SIST ISO 10708:1997
0 IS0
IS0 10708: 1997(E)
Foreword
lS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (IS0
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through IS0 technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. IS0 collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard IS0 10708 was prepared by Technical Committee ISOTTC 147, Water quality, Subcommittee
SC 5, Biological methods.
Annexes A to E of this International Standard are for information only.

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SIST ISO 10708:1997
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SIST ISO 10708:1997
llS010708:1997( E)
INTERNATIONAL STANDARD 0 IS0
- EMuation in an aqueous medium of the ultimate
Water quality
aerobic biodegradability of organic compounds - Determination
of biochemical oxygen demand in a two-phase closed bottle test
WARNING - SAFETY PRECAUTIONS - Activated sludge and sewage may contain potentially pathogenic
organisms. Therefore appropriate precautions should be taken when handling them. Toxic test compounds
and those whose properties are unknown should be handled with care.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the evaluation of the ultimate biodegradability by aerobic
microorganisms of organic compounds, in particular poorly water-soluble compounds, at a given concentration.
NOTE 1 The conditions described in this international Standard do not necessarily always correspond to the optimal
conditions allowing the maximum degree of biodegradation to occur.
The method applies to organic compounds which
-
are water soluble or poorly water soluble at the concentration used under the test conditions;
- do not adsorb onto or have any effect on the oxygen electrode (see 8.1.2 and 8.3.4);
-
are not inhibitory to the test microorganisms at the concentration chosen for the test.
NOTE 2 For special measures to introduce poorly water-soluble test compounds into the test vessels, see IS0 10634.
NOTE 3 Inhibitory effects can be determined as described in 8.1.4 and 8.3.1, or by using any other method for determining
the inhibitory effect on bacteria of a substance (e.g. IS0 8192).
2 Normative reference
The following standard contains provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this
International Standard. At the time of publication, the edition indicated was valid. All standards are subject to
revision, and parties to agreements based on this International Standard are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent edition of the standard indicated below. Members of IEC and IS0 maintain
registers of currently valid International Standards.
IS0 10634: 1995, Water quality - Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic
compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
3 Definitions
For the purposes of this International Standard, the following definitions apply.

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0 IS0
IS0 10708:1997(E)
31 ultimate biodegradation
bieakdown of an organic chemical compound by microorganisms in the presence of oxygen to yield carbon dioxide,
water and mineral salts of any other elements present (mineralization) and new biomass
3.2 primary biodegradation
structural change (transformation) of an organic chemical compound by microorganisms resulting in the loss of a
specific property
3.3 biochemical oxygen demand (BOD)
mass concentration of dissolved oxygen consumed under specified conditions by the aerobic biological oxidation of
a chemical compound or organic matter in water, expressed in this case as milligrams of oxygen uptake per
milligram or gram of test compound
theoretical oxygen demand (ThOD)
3.4
theoretical maximum amount of oxygen required to oxidize a chemical compound completely, calculated from the
molecular formula, expressed in this case as milligrams of oxygen required per milligram or gram of test compound
3.5 chemical oxygen demand (COD)
mass concentration of oxygen equivalent to the amount of a specified oxidant consumed by a chemical compound
or organic matter when a water sample is treated with that oxidant under defined conditions, expressed in this case
as milligrams of oxygen consumed per milligram or gram of test compound
3.6 dissolved organic carbon (DOC)
that part of the organic carbon in water which cannot be removed by specified phase separation, for example by
-* for 15 min or by membrane filtration using membranes with pores of 0,2 pm to
centrifugation at 40 000 ms
0,45 pm diameter
3.7 concentration of suspended solids of an activated sludge
amount of solids obtained by filtration or centrifugation of a known volume of activated sludge after filtration or
centrifugation and drying at about 105 “C to constant mass
3.8 lag phase
time from the start of a test until adaptation and selection of the degrading microorganisms are achieved and the
biodegradation degree of a chemical compound or organic matter has increased to about 10 % of the theoretical
maximum biodegradation; it is expressed in days
3.9 maximum level of biodegradation
maximum biodegradation degree of a chemical compound or organic matter in a test, above which no further
biodegradation takes place during the test; it is expressed as a percentage
3.10 degradation phase
time from the end of the lag phase of a test until about 90 % of the maximum level of biodegradation has been
reached; it is expressed in days
3.11 plateau phase
time from the end of the biodegradation phase when the maximum level of biodegradation is reached until the end
of the test
3.12 pre-exposure
pre-incubation of an inoculum in the presence of the test compound, with the aim of enhancing the ability of an
inoculum to biodegrade the test compound by adaptation and selection of the microorganisms
3.13 pre-conditioning
pre-incubation of an inoculum under the conditions of the test in the absence of the test compound, with the aim of
improving the performance of the test by acclimatization of the microorganisms to the test conditions
2

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SIST ISO 10708:1997
0 IS0 IS0 10708: 1997(E)
4 Principle
Biodegradation of organic compounds by aerobic microorganisms is determined in an aquatic medium. The organic
compound is the sole source of carbon and energy in the medium. The inoculated medium is shaken or stirred in
closed bottles, containing known volumes of medium and air, to assure steady-state oxygen partitioning between
liquid and gas phases. The degradation is followed by regular measurements of the dissolved oxygen concentration
in the aqueous phase for up to 28 days The total oxygen uptake in the test flasks is calculated from the difference
in the measured dissolved oxygen concentrations in the blank and test flasks divided by the oxygen saturation value
under normal conditions and multiplied by the total oxygen content originally present in the liquid and gaseous
phases. Biodegradability is calculated as the total oxygen uptake divided by the theoretical oxygen demand (ThOD)
or chemical oxygen demand (COD), expressed as a percentage.
5 Test environment
Incubation shall take place in the dark or in diffused light in an enclosure which is maintained at a constant
temperature (5 0,5 “C) in a range between 20 “C and 25 “C.
6 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade.
6A Water
Distilled or deionized water containing less than 2 mg/l of DOC and/or less than IO % of the initial organic carbon
content introduced by the test compound.
6.2 Test medium
6.2.1 Composition
6.2.1 .I Solution A
Anhydrous potassium dihydrogenphosphate (KH,PO,)
895 g
Anhydrous dipotassium hydrogenphosphate (K,HPO,) 21,75 g
Disodium hydrogenphosphate dihydrate (Na,HPO,-2H,O)
3w g
Ammonium chloride (NH&l)
095 g
Water (6.1) in a quantity necessary to make up to 1 litre
NOTE - The correct composition of the medium can be checked by measuring the pH value, which should be 7,4.
6.2.1.2 Solution B
Dissolve 22,5 g of magnesium sulfate heptahydrate (MgS04=7H,0) in 1 000 ml of water (6.1).
6.2.1.3 Solution C
Dissolve 27,5 g of anhydrous calcium chloride (CaCI,) in 1 000 ml of water (6.1).

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0 IS0
IS0 10708:1997(E)
6.2.1.4 Solution D
this solution
Dissolve 0,25 g of iron(lll) chloride hexahydrate (FeCls~GH,O) in 1 000 ml of water (6.1). Prepare
freshly before use.
NOTE - It is not necessary to prepare this solution just before use if a drop of concentrated hydrochloric acid ( HCI) or 0,4 g/l
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) is added.
6.2.2 Preparation
For 1 litre of test medium, add to about 500 ml of water (6.1)
- 10 ml of solution A;
- 1 ml of each of the solutions B to D.
Make up to 1 000 ml with water (6.1).
6.3 Sodium hydroxide solution
Dissolve sodium hydroxide (NaOH) in water (6.1) to obtain a solution of 0,l mol/l to 0,5 mol/I.
6.4 Hydrochloric acid solution
Dissolve hydrochloric acid (HCI) in water (6.1) to obtain a solution of 0,l mol/l to 0,5 mol/l.
7 Apparatus
and, in particular, is free from organic or toxic matter. Use usual
Ensure that all glassware is thoroughly cleaned
laboratory equipment and the following items.
7.1 Incubation bottles, gas-tight, e.g. narrow-neck flasks with volumes of 200 ml to 300 ml with suitable stoppers
(e.g. ground-glass stoppers, screw-caps or butyl rubber stoppers), shielded from light (e.g. made of brown glass).
It is recommended to use stopper clamps. Mark each bottle with waterproof markings. If the oxygen electrode used
has no mounted stirrer, provide each bottle with a magnetic stirrer-bar coated with polytetrafluorethylene. Either pre-
select bottles of standard volume such that the standard deviation about the mean volume of the batch of bottles is
less than 1 ml, or measure and record the volumes of individual, numbered bottles to an accuracy of 1 ml. Carefully
grease the stoppers of the bottles with inert silicone grease to assure proper closing and easy removal.
7.2 Oxygen electrode to measure over a range of 0 mg/l to IO mg/l with a precision of 1 %.
Steady-state shall be reached within about 2 min. Mount the electrode for example in an inert stopper which makes
a leak-proof fit in the ground glass neck of the incubation bottle. Preferably use electrodes with mounted stirrers.
7.3 Magnetic stirrer with speed regulation, if required.
Stirrer-rods attached to the oxygen electrode shall be of such a material that no ingredients of any plastic coatings
will contaminate the test medium and no adsorption of test compounds will occur. Heating the test vessels by
stirring and raising the test temperature shall be avoided.
7.4 Shaking device, if required.
7.5 Water bath, or other device to guarantee an accurate temperature control of + 0,5 “C in a range of 20 “C to
25 “C.
7.6 pH-meter.
4

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0 IS0 IS0 10708: 1997(E)
7.7 Dissolved organic carbon (DOC) analyser (only in special cases, see 8.3.4, note 3).
8 Procedure
8.1 Preparation of test and reference compounds
8.1 .I Water-soluble test compounds
Prepare a stock solution of water-soluble test compounds in water (6.1) or test medium (6.2). Dilute a suitable
amount of this solution in the test medium (6.2) to obtain a final test concentration which corresponds to 100 mg/l
ThOD (see 8.3.3). For calculation of ThOD, see annex A. If ThOD cannot be calculated from the formula, use
elemental analyses or determine COD (see annex B). Be aware that COD determination of poorly water-soluble
substances may be difficult. If DOC removal is to be determined, measure the equivalent DOC test concentration (in
milligrams per litre) or calculate it from the measured stock solution.
8.1.2 Water-insoluble test compounds
Grind dry solids in a mortar, weigh them on a piece of glass and place directly into the test bottles. Smear oily and
waxy substances onto a piece of glass and, after reweighing, place directly into the test bottles.
If dispersions or emulsions are used, disperse the test compound in water (6.1) by ultrasonic treatment or emulsify
with a non-biodegradable emulsifier, or use both techniques in combination. A suitable emulsifier is nonylphenol
ethoxylate (about IO EO) and propoxylate (about 3 to 7 PO). Ensure that the dispersion or emulsion is
homogeneous when an aliquot is used to obtain the desired test concentration.
Ensure that the final amount of test compound in the test vessel is at about 100 mg/l of ThOD (see annex A). It is
not important to adjust exactly to 100 mg/l, but record the exact amount for each numbered bottle.
For further information on handling of poorly water-soluble test compounds, see IS0 10634.
NOTE - If the test compound (e.g. an oily or fatty substance) adsorbs on the oxygen electrode, the oxygen measurement may
be reduced and the test results could be influenced. Adsorption can also occur on the bottle walls or the stoppers. If this
occurs, use another test method [e.g. the respirometer test (IS0 9408) or the C02-evolution test (IS0 9439)].
8.1.3 Solution of the reference compound
Prepare a stock solution of the reference compound (an organic compound of known biodegradability such as
sodium acetate, sodium benzoate or aniline) in the same way as in 8.1 .I in order to obtain a final test concentration
which corresponds to a 100 mg/l ThOD.
8.1.4 Solution to check inhibition
If information on a possible inhibition of the inoculum by the test compound is desired, prepare in the test medium
(6.2) a solution containing the test compound and the reference compound in the respective concentrations
indicated in 8.1 .I, 8.1.2 and 8.1.3.
8.2 Preparation of the inoculum
Prepare the inoculum using the sources as described in 8.2.1 to 8.2.3 or use a mixture of these sources to obtain a
microbial population that offers sufficient biodegradative activity. Stabilize the inoculum as described in 8.3.2 before
use in the test.
8.2.1 lnoculum from a secondary effluent
Take a sample of a secondary effluent collected from a treatment plant or a laboratory plant dealing with
predominantly domestic sewage. If the density of microorganisms in the inoculum is too low so that the
requirements for suitable volume [see b)] cannot be fulfilled, concentrate the sample by filtration or centrifugation.
Mix well, keep the sample under aerobic conditions and use preferably on the day of collection.
5

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SIST ISO 10708:1997
0 IS0
IS0 10708:1997(E)
From this sample, prepare an inoculum as follows.
a) Let the sample of effluent settle for 1 h.
b) Take a suitable volume of the supernatant, to be used as inoculum, where suitable volume means
-
sufficient to give a population which offers enough biodegradation activity;
-
degrades the reference compound by the stipulated percentage;
- gives between 104 to 108 active cells per millilitre;
- gives not greater than the equivalent of 30 mg/l suspended solids of activated sludge in the final mixture.
8.2.2 lnoculum from an activated sludge plant
Take a sample of activated sludge collected from the aeration tank of a treatment plant or a laboratory plant dealing
with predominantly domestic sewage. Mix well, keep the sample under aerobic conditions and use preferably on the
day of collection.
Before use, determine the concentration of suspended solids (use e.g. IS0 11923). If the concentration of
suspended solids is very low, concentrate the sludge by settling so that the volume of sludge added to the test
assay is minimal. If many coarse particles are in the sludge, separation is necessary. Put the sludge through a fine
sieve and wash repeatedly with test medium (6.2). Subsequently centrifuge or settle the sludge, discard the liquid
phase and resuspended the solids in test medium to obtain a concentration of solids of about 3 g/l. Use a volume
which gives no more than 30 mg/l of suspended solids in the final mixture.
8.2.3 lnoculum from a surface water
Take a sample of an appropriate surface water. If the amount of microorganisms in the inoculum is too low and
does not fulfil the requirements indicated in 8.2.1, concentrate the sample by filtration or centrifugation. Keep the
sample under aerobic conditions and use preferably on the day of collection. Take a suitable volume as inoculum
(8.2.1).
NOT
...

NORME
INTERNATIONALE 10708
Première édition
1997-02-01
- Évaluation en milieu
Qualité de l’eau
aqueux de la biodégradabilité aérobie
ultime des composés organiques -
Détermination de la demande biochimique
en oxygène en fiole fermée à deux phases
M/ater quality - Evaluation in an aqueous medium of the ultimate aerobic
biodegradability of organic compounds - De termina tion of biochemical
oxygen demand in a two-phase closed bottle test
Numéro de référence
ISO 10708: 1997(F)

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ISO 10708:1997(F)
Sommaire
1
1 Domaine d’application . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Il
2 Référence normative . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .*.*.
3 Définitions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
4 Principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .“. 3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .~.~.~. 3
5 Environnement d’essai
3
6 Réactifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
7 Appareillage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8 Mode opératoire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
9
9 Calcul et expression des résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .~.~. 11
10 Validité de l’essai
.................................................................................................................................................... 11
11 Rapport d’essai
................................................ 13
Annexe A (informative) Calcul de la demande théorique en oxygène (DThO)
..................................... 14
Annexe B (informative) Détermination de la demande chimique en oxygène (DCO)
Annexe C (informative) Correction de la consommation en oxygène pour éliminer l’interférence
15
avec la nitrification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .*.
17
Annexe D (informative) Exemple de courbe de dégradation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
Annexe E (informative) Bibliographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .*.
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
Internet central @ iso.ch
x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
II

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0 ISO
ISO10708:1997(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
L’ISO collabore étroitement avec la Commission
liaison avec I’ISO participent également aux travaux.
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 10708 a été élaborée par le comité technique ISOTTC 147, Qualité de /‘eau, sous-
comité SC 5, Méthodes biologiques.
Les annexes A, B, C, D et E de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d’information.
. . .
Ill

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Page blanche

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NORME INTERNATIONALE @ ISO ISO 10708:1997(F)
- Évaluation en milieu aqueux de la
Qualité de l’eau
biodégradabilité aérobie ultime des composés organiques -
Détermination de la demande biochimique en oxygène en fiole
fermée à deux phases
AVERTISSEMENT - PRÉCAUTIONS DE SÉCURITÉ - Les boues activées et les eaux usées peuvent contenir
des organismes potentiellement pathogènes. II convient donc de prendre des précautions appropriées en
les manipulant. II convient également de manipuler avec précaution les composés d’essai toxiques et ceux
dont on ne connaît pas les propriétés.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale prescrit une méthode pour l’évaluation de la biodégradabilité ultime des
composés organiques, sous l’action de micro-organismes aérobies, notamment les composés peu solubles dans
l’eau, présents à une concentration donnée.
NOTE 1 Les conditions décrites dans la présente Norme internationale ne correspondent pas nécessairement aux conditions
optimales d’obtention du niveau maximal de biodégradation.
La présente méthode est applicable aux composés organiques qui
-
sont solubles dans l’eau ou peu solubles dans l’eau à la concentration utilisée dans les conditions de l’essai;
-
n’adsorbent pas, ou n’ont pas d’effet sur l’électrode à oxygène (voir 8.1.2 et 8.3.4);
-
ne sont pas inhibiteurs vis-à-vis des micro-organismes d’essai à la concentration choisie pour l’essai.
NOTE 2 Concernant les mesures spéciales permettant d’introduire, dans les récipients d’essai, des composés à expérimenter
peu solubles dans l’eau, voir I’ISO 10634.
NOTE 3 Les effets inhibiteurs peuvent être déterminés comme décrit en 8.1.4 et 8.3.1, ou à l’aide de toute autre méthode
permettant de déterminer l’effet inhibiteur d’une substance sur les bactéries (voir par exemple I’ISO 8192).
2 Références normatives
La norme suivante contient des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Au moment de la publication, l’édition indiquée était en
vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente Norme
internationale sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer l’édition la plus récente de la norme indiquée ci-
après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur à un
moment donné.
ISO 10634:1995, Qualité de l’eau - Lignes directrices pour la préparation et le traitement des composés organiques
peu solubles dans l’eau en vue de l’évaluation de leur biodégradabilité en milieu aqueux.

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ISO 10708:1997(F)
3 Définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les définitions suivantes s’appliquent.
31 biodégradation ultime
trksformation totale d’un composé chimique organique par les micro-organismes, en présence d’oxygène, en
dioxyde de carbone, eau, sels minéraux de tout autre élément présent (minéralisation) et nouveaux constituants
cellulaires microbiens (biomasse)
3.2 biodégradation primaire
transformation structurelle d’un composé chimique organique par les micro-organismes, résultant en la perte d’une
propriété spécifique
3.3 demande biochimique en oxygène (DBO)
concentration en masse d’oxygène dissous consommé, dans des conditions définies, lors de l’oxydation biologique
aérobie d’un composé chimique ou d’une matière organique dans l’eau; exprimée ici en milligrammes d’oxygène
consommé par milligramme ou par gramme de composé à expérimenter
3.4 demande théorique en oxygène (DThO)
quantité maximale théorique d’oxygène nécessaire pour oxyder complètement un composé chimique, calculée à
partir de la formule moléculaire; exprimée ici en milligrammes d’oxygène requis par milligramme ou par gramme de
composé à expérimenter
3.5 demande chimique en oxygène (DCO)
concentration en masse d’oxygène, équivalente à la quantité d’oxydant spécifié consommé par un composé
chimique ou une matière organique lorsqu’un échantillon d’eau est traité avec cet oxydant dans les conditions
définies; exprimée ici en milligrammes d’oxygène consommé par milligramme ou par gramme de composé à
expérimenter
3.6 carbone organique dissous (COD)
partie du carbone organique dans l’eau qui ne peut être éliminé par la séparation des phases spécifiée, par
exemple par centrifugation à 40 000 ms-* pendant 15 min, ou par filtration sur membrane d’un diamètre de pores
de 0,2 prn à 0,45 prn
3.7 concentration des matières en suspension dans une boue activée
quantité de matière solide obtenue par filtration ou centrifugation d’un volume connu de boue activée après filtration
ou centrifugation puis séchage à environ 105 “C jusqu’à masse constante
3.8 phase de latente
durée comprise entre le début d’un essai et la fin de l’adaptation et de la sélection des micro-organismes de
dégradation, ainsi que l’augmentation du taux de biodégradation d’un composé chimique ou d’une matière
organique jusqu’à environ 10 % du niveau théorique maximal de biodégradation; exprimée en jours
3.9 niveau maximal de biodégradation
taux maximal de biodégradation d’un composé chimique ou d’une matière organique dans un essai au-delà duquel
aucune biodégradation ne survient plus pendant l’essai; exprimé en pourcentage
3.10 phase de dégradation
durée comprise entre la fin de la phase de latente d’un essai et l’instant où environ 90 % du niveau maximal de
biodégradation est atteint; exprimé en pourcentage
3.11 phase de plateau
durée comprise entre la fin de la phase de biodégradation, lorsque le niveau maximal de biodégradation a été
atteint, et la fin de l’essai

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3.12 préexposition
préincubation d’un inoculum en présence du composé à expérimenter, destinée à accroître l’aptitude de I’inoculum
à dégrader le composé par adaptation et sélection des micro-organismes
3.13 préconditionnement
préincubation d’un inoculum dans les conditions d’essai, mais en l’absence du composé à expérimenter, destinée à
améliorer l’efficacité de l’essai par acclimatation des micro-organismes aux conditions de l’essai
4 Principe
La biodégradation des composés organiques par des micro-organismes aérobies est déterminée dans un milieu
aquatique. Le composé organique constitue la seule source de carbone et d’énergie dans ce milieu. Le milieu
inoculé est agité ou remué dans des fioles fermées, contenant des volumes connus de milieu et d’air, afin d’assurer
un état stable de la répartition de l’oxygène entre les phases liquide et gazeuse. La dégradation est suivie par des
mesurages réguliers de la concentration en oxygène dissous dans la phase aqueuse sur une période pouvant
atteindre 28 jours. La quantité totale d’oxygène consommée dans les fioles d’essai est calculée à- partir de la
différence entre les concentrations en oxygène dissous mesurées dans la fiole d’essai à blanc et dans les fioles
d’essai, divisée par la valeur de saturation de l’oxygène dans des conditions normales, et multipliée par la teneur
totale en oxygène présent à l’origine dans les phases gazeuse et liquide. La biodégradabilité est calculée à partir de
la consommation totale en oxygène, divisée par la demande théorique en oxygène (DThO) ou la demande chimique
en oxygène (DCO), exprimée en pourcentage.
5 Environnement d’essai
L’incubation doit être menée à l’obscurité ou sous lumière diffuse, dans une enceinte maintenue à une température
constante (? 0,5 OC) comprise entre 20 “C et 25 OC.
6 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
6.1 Eau
Eau distillée ou déionisée contenant moins de 2 mg/1 de COD et/ou moins de 10 % de la teneur initiale en carbone
organique introduite par le composé à expérimenter.
6.2 Milieu d’essai
6.2.1 Composition
6.2.1 .l Solution A
Dihydrogénophosphate de potassium anhydre (KH,PO,)
83 g
Monohydrogénophosphate de potassium anhydre (K,HPO,) 21,75 g
Monohydrogénophosphate de sodium dihydraté (Na,HP0,,2H,O)
3w g
Chlorure d’ammonium (NH,CI)
095 g
Eau (6.1) q.s.p. 1 litre
3

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NOTE - La composition correcte du milieu peut être vérifiée en mesurant la valeur du pH. II est recommandé que cette valeur
soit de 7,4.
6.2.1.2 Solution B
Dissoudre 22,5 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO,,-/H,O) dans 1 000 ml d’eau (6.1).
6.2.1.3 Solution C
Dissoudre 27,5 g de chlorure de calcium anhydre (CaC12) dans 1 000 ml d’eau (6.1).
6.2.1.4 Solution D
Dissoudre 0,25 g de chlorure de fer(lll) hexahydraté (FeCI,,GH,O) dans 1 000 ml d’eau (6.1). Préparer cette
solution juste avant l’emploi.
NOTE - Pour éviter d’avoir à préparer cette solution juste avant l’emploi, ajouter une goutte d’acide chlorhydrique concentré
(HCI) ou 0,4 g/l d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
6.2.2 Préparation du milieu d’essai
Pour 1 litre de milieu d’essai, ajouter à environ 500 ml d’eau (6.1):
- 10 ml de la solution A;
- 1 ml de chacune des solutions B à D.
Compléter à 1 000 ml avec de l’eau (6.1).
6.3 Solution d’hydroxyde de sodium
Dissoudre de l’hydroxyde de sodium (NaOH) dans l’eau (6.1) pour obtenir une solution entre 0,l mol/1 et 0,5 mol/l.
6.4 Solution d’acide chlorhydrique
Dissoudre de l’acide chlorhydrique (HCI) dans l’eau (6.1) pour obtenir une solution entre 0,l mol/1 et 0,5 mol/l.
7 Appareillage
S’assurer que la verrerie est totalement propre, et plus particulièrement, qu’elle est exempte de matières
organiques ou toxiques. Utiliser le matériel courant de laboratoire, et ce qui suit.
7.1 Fioles d’incubation, étanches aux gaz, par exemple des fioles à col étroit, de 200 ml à 300 ml de volume,
munies de bouchons appropriés (tels que des bouchons en verre rodé, bouchons à vis ou bouchons en caoutchouc
butyle), protégées de la lumière (par exemple réalisées en verre brun). II est recommandé d’utiliser des bouchons à
pinces.
Marquer chacune des fioles de façon indélébile. Si l’électrode à oxygène utilisée n’a pas d’agitateur incorporé,
équiper chaque fiole d’un agitateur magnétique recouvert de polytétrafluoroéthylène. Présélectionner des fioles d’un
volume type tel que l’écart-type de part et d’autre du volume moyen du lot de fioles soit inférieur à 1 ml, ou mesurer
puis enregistrer les volumes individuels des fioles numérotées avec une exactitude de 1 ml. Graisser
soigneusement les bouchons des fioles avec une graisse silicone neutre afin d’assurer une fermeture correcte tout
en permettant de retirer le bouchon facilement.
7.2 Électrode à oxygène, destinée à mesurer dans la gamme allant de 0 mg/l à 10 mg/l, avec une précision de
0
1 / 0.
4

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L’état stable doit être atteint en 2 min environ. Monter l’électrode, par exemple dans un bouchon inerte s’adaptant
parfaitement dans le col en verre rodé de la fiole d’incubation. Utiliser de préférence des électrodes à agitateur
incorporé.
7.3 Agitateurs magnétiques, à régulation de vitesse, si nécessaire.
Les agitateurs fixés à l’électrode à oxygène doivent être réalisés en un matériau tel qu’aucun des composants des
revêtements plastiques ne vienne contaminer le milieu d’essai et qu’aucune adsorption des composés à
expérimenter ne se produise. Chauffer les récipients d’essai en les agitant et en augmentant la température d’essai
doit être évité.
7.4 Dispositif d’agitation, si nécessaire.
7.5 Bain d’eau, ou tout dispositif garantissant un contrôle exact de la température, à + 0,5 “C dans la gamme
allant de 20 “C à 25 “C.
7.6 pH-mètre.
7.7 Analyseur de carbone organique dissous (COD) (seulement dans les cas spécifiques, voir la note 3 en
8.3.4).
8 Mode opératoire
8.1 Préparation du composé à expérimenter et du composé de référence
_ 8.1 .l Composés à expérimenter solubles dans l’eau
Préparer dans l’eau (6.1) ou dans le milieu d’essai (6.2), une solution mère des composés à expérimenter solubles
dans l’eau. Diluer une quantité suffisante de cette solution dans le milieu d’essai (6.2) afin d’obtenir une
concentration d’essai finale correspondant à 100 mg/l de DThO (voir 8.3.3). Pour le calcul de la DThO, voir
l’annexe A. S’il n’est pas possible de calculer la DThO à partir de la formule, utiliser les analyses élémentaires ou
déterminer la DC0 (voir l’annexe B). II faut être conscient du fait que la détermination de la DC0 des substances
peu solubles dans l’eau peut s’avérer difficile. Lorsque la réduction de la DC0 doit être déterminée, mesurer la
concentration équivalente de l’essai DC0 (en milligrammes par litre) ou la calculer à partir de la solution mère
mesurée.
8.1.2 Composés à expérimenter non solubles dans l‘eau
Broyer les matières solides sèches dans un mortier, les peser sur une plaque de verre puis les placer directement
dans les fioles d’essai. Étaler les substances de type huileux ou paraffineux sur une plaque de verre puis, après
avoir pesé de nouveau, les placer directement dans les fioles d’essai.
Lorsque des dispersions ou des émulsions sont utilisées, disperser le composé à expérimenter dans de l’eau (6.1)
à l’aide d’un traitement par ultrasons, ou l’émulsionner à l’aide d’un émulsifiant non biodégradable, ou bien utiliser
les deux techniques combinées. L’éthoxylate de nonylphénol (environ 10 EO) et le propoxylate (environ 3 à 7 PO)
constituent des émulsifiants adaptés. S’assurer que la dispersion ou l’émulsion est homogène en cas d’utilisation
d’une aliquote pour obtenir la concentration d’essai souhaitée.
S’assurer que la quantité finale de composé à expérimenter dans le récipient d’essai est à environ 100 mg/l de
DThO (voir l’annexe A). II n’est pas nécessaire d’obtenir exactement 100 mg/l, mais noter la quantité exacte pour
chaque fiole numérotée.
Pour toute information complémentaire concernant la manipulation des composés à expérimenter peu solubles
dans l’eau, voir I’ISO 10634.
NOTE - Si le composé à expérimenter (par exemple une substance de type huileux ou
gras) adsorbe sur l’électrode à
oxygène, le mesurage de l’oxygène peut être réduit et les résultats d’essai peuvent être
influencés. Une adsorption peut
5

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également se produire sur les parois du flacon ou sur les bouchons. Si tel est le cas, choisir une autre méthode d’essai [par
exemple l’essai respirométrique (ISO 9408) ou l’essai de dégagement de CO, (ISO 9439)].
8.13 Solution du composé de référence
Préparer une solution mère du composé de référence (un composé organique de biodégradabiiité connue, tel que
l’acétate de sodium, le benzoate de sodium ou I’aniline) de la même façon qu’en 8.1.1, afin d’obtenir une
concentration d’essai finale correspondant à 100 mg/1 de DThO.
8.1.4 Solution de contrôle de l’inhibition
Si l’on souhaite obtenir des informations sur le risque d’inhibition de I’inoculum par le composé à expérimenter,
préparer, dans le milieu d’essai (6.2), une solution contenant le composé à expérimenter et le composé de
référence aux concentrations respectives indiquées en 8.1 .l , 8.1.2 et 8.1.3.
8.2 Préparation de I’inoculum
Préparer I’inoculum à partir des sources décrites en 8.2.1 à 8.2.3 ou d’un mélange de ces sources, afin d’obtenir
une population microbienne offrant une activité de biodégradation suffisante. Stabiliser I’inoculum comme décrit en
8.3.2 avant de l’utiliser dans l’essai.
8.2.1 Inoculum provenant d’un effluent secondaire
Prélever un échantillon provenant d’un effluent secondaire d’une usine de traitement des eaux ou d’un laboratoire
traitant principalement des eaux usées domestiques. Si la densité de micro-organismes dans I’inoculum est si faible
qu’elle ne remplit pas les exigences de volume convenable [voir b)], concentrer l’échantillon par filtration ou
centrifugation. Bien mélanger, conserver l’échantillon dans des conditions aérobies et l’utiliser de préférence le jour
du prélèvement.
À partir de cet échantillon, préparer un inoculum comme suit.
a) Laisser décanter l’échantillon d’effluent pendant 1 h.
Prélever un volume convenable du liquide surnageant afin de l’utiliser comme inoculum; un volume est dit
b)
convenable,
-
s’il permet d’obtenir une population offrant une activité de biodégradation suffisante;
-
s’il assure la dégradation du composé de référence au pourcentage spécifié;
-
s’il fournit entre 104 et lO* cellules actives par millilitre;
-
s’il ne fournit pas, dans le mélange final, plus de l’équivalent de 30 mg/1 de matières solides en suspension
dans les boues activées.
8.2.2 Inoculum provenant d’une usine de traitement des boues activées
Prendre un échantillon de boue activée prélevé dans le réservoir d’aération d’une usine de traitement des eaux ou
d’un laboratoire traitant principalement des eaux usées domestiques. Bien mélanger, conserver l’échantillon dans
des conditions aérobies et l’utiliser de préférence le jour du prélèvement.
Avant l’emploi, déterminer la concentration de matières solides en suspension (utiliser par exemple I’ISO 11923). Si
la concentration de matières en suspension est très faible, concentrer la boue par décantation, de sorte que le
volume de boue ajouté à l’échantillon d’essai soit le plus faible possible. Si de nombreuses particules grossières
sont présentes dans la boue, une séparation est nécessaire. Filtrer la boue à travers un filtre fin et rincer plusieurs
fois à l’aide du milieu d’essai (6.2). Puis centrifuger ou laisser décanter la boue, rejeter la phase liquide et remettre
les matières solides en suspension dans le milieu d’essai afin d’obtenir une concentration de matières solides .
d’environ 3 g/l. Utiliser un volume tel qu’il ne fournit pas plus de 30 mg/1 de matières en suspension dans le mélange
final.
6

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8.2.3 Inoculum provenant d’une eau de surface
Prélever un échantillon d’une eau de surface appropriée. Si la quantité de micro-organismes dans I’inoculum est
trop faible et ne remplit pas les exigences de volume convenable indiquées en 8.2.1, concentrer l’échantillon par
filtration ou centrifugation. Conserver l’échantillon dans des conditions aérobies et l’utiliser de préférence le jour du
prélèvement. Prendre un volume d’inoculum convenable (voir 8.2.1).
NOTE - Dans certaines circonstances, il est admis d’utiliser des inocula préexposés, à condition que cela soit clairement
mentionné dans les résultats d’essai (par exemple, pourcentage de biodégradation = x %, avec inocula préexposés) et que la
méthode de préexposition soit détaillée dans le rapport d’essai. Des inocula préexposés peuvent être obtenus à partir d’essais
de biodégradation en laboratoire effectués dans différentes conditions [par exemple, essai de Zahn-Wellens (ISO 9888) ou
essai SCAS (ISO 9887)] ou à partir d’échantillons prélevés à des emplacements ou sont réunies les conditions
d’environnement appropriées (par exemple usine assurant le traitement de composés identiques ou zones contaminées).
8.3 Mode opératoire d’essai
8.3.1 Préparation des fioles d’essai
Préparer un nombre suffisant de fioles d’incubation (7.1) afin d’obtenir
-
au moins trois fioles contenant le composé à expérimenter (8.1 .l ou 8.1.2) et le milieu d’essai inoculé (6.2 et 8.2)
(fioles FT);
-
au moins trois fioles d’essai à blanc contenant le milieu d’essai inoculé (6.2 et 8.2) (fioles Fg);
-
au moins trois fioles de vérification du mode opératoire, contenant le composé de référence (8.1.3) et le milieu
d’essai inoculé (6.2 et 8.2) (fioles F,);
-
si nécessaire, au moins une fiole destinée à vérifier un éventuel effet inhibiteur du composé à expérimenter,
contenant la solution de 8.1.4 et le milieu d’essai inoculé (6.2 et 8.2) (fiole FI);
-
si nécessaire, au moins une fiole destinée à vérifier une éventuelle élimination abiotique, contenant le composé
à expérimenter (8.1 .l ou 8.1.2), mais sans inoculum, stérilisée par ajout de, par exemple, 1 ml/1 d’une solution
contenant 10 g/l de chlorure mercure (HgCI,), ou de tout autre composé inorganique toxique propre à
empêcher l’activité microbienne (fiole FS). Si des substances très facilement dégradables sont soumises à
l’essai, ajouter la même quantité de substance toxique deux semaines après le début de l’essai.
8.3.2 Stabilisation du milieu inoculé
Préparer un milieu d’essai (6.2) suffisant pour réaliser l’essai complet, l’inoculer et le répartir entre les fioles d’essai.
Si par exemple de la boue activée est utilisée comme inoculum, prendre environ 800 ml du milieu d’essai (6.2),
ajouter 10 ml d’inoculum (8.2.2), puis compléter à 1 000 ml avec le milieu d’essai (6.2). La concentration de
matières solides en suspension ne doit pas excéder 30 mg/l.
Placer un agitateur magnétique dans chaque fiole (si un dispositif d’agitation n’est pas utilisé et/ou si l’électrode à
oxygène n’est pas équipée d’un agitateur incorporé) et ajouter un volume bien mélangé de milieu inoculé,
correspondant aux deux tiers du volume libre de la fiole (par exemple 200 ml de liquide dans des fioles de 300 ml).
Placer les fioles fermées sur le dispositif d’agitation ou les agiter, et incuber entre 20 “C et 25 “C pendant une
semaine. Pendant cette période, les bactéries utiliseront leur matériau de réserve et I’inoculum se stabilisera.
8.3.3 Début de l’essai
Aérer les fioles d’essai contenant le milieu inoculé stabilisé (8.3.2) avec de l’air comprimé saturé en eau et un
diffuseur d’air, pendant environ 15 min. Mesurer la concentration initiale en oxygène, ce qui est recommandé, ou la
calculer (voir 8.3.4). Ajouter aux fioles FT une quantité appropriée de la solution mère du composé à expérimenter
(8.1 .l), ou ajouter directement les substances d’essai peu solubles dans l’eau (8.1.2) afin d’obtenir la concentration
d’essai souhaitée qui est normalement de 100 mg/l de DThO par fiole. Ajouter aux fioles F, une quantité appropriée
de solution mère du composé de référence (8.1.3) et, à la fiole F,, les mêmes quantités de composé à expérimenter
et de composé de référence (8.1.4). Pour la fiole F,, utiliser un milieu d’essai non inoculé (6.2) et ajouter la même
7

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quantité de composé à expérimenter que pour les fioles F,. S’assurer que toutes les fioles contiennent les mêmes
volumes d’eau et d’air (voir 8.3.2); ajouter de l’eau (6.1) si nécessaire.
Boucher toutes les fioles hermétiquement (par exemple à l’aide de bouchons à pinces), les placer sur le dispositif
d’agitation et les incuber à température constante (à + 0,5 “C) entre 20 “C et 25 “C. Au lieu d’utiliser un dispositif
d’agitation, il est possible d’agiter les fioles à l’aide d’un agitateur magnétique.
8.3.4 Analyse
Étalonner avec précision l’électrode à oxygène selon les instructions du fabricant.
II convient d’étalonner le point zéro, la valeur de saturation et la dérive, en plaçant par exemple l’électrode dans une
eau saturée d’air à 20 “C + 0,5 OC. II convient d’ajuster la lecture de la valeur de saturation de l’oxygène dissous
dans l’eau à 9,08 mg/l, valeur théorique à la pression atmosphérique normale (1 013 hPa) et 20 OC. Les valeurs
pour l’oxygène se lisent normalement sur une échelle de 0 mg/l à 10 mg/l, avec une précision de 0,l mg/l. Il n’est
pas nécessaire de corriger les variations de la pression atmosphérique.
NOTE 1 Si le composé à expérimenter est susce
...

NORME
INTERNATIONALE 10708
Première édition
1997-02-01
- Évaluation en milieu
Qualité de l’eau
aqueux de la biodégradabilité aérobie
ultime des composés organiques -
Détermination de la demande biochimique
en oxygène en fiole fermée à deux phases
M/ater quality - Evaluation in an aqueous medium of the ultimate aerobic
biodegradability of organic compounds - De termina tion of biochemical
oxygen demand in a two-phase closed bottle test
Numéro de référence
ISO 10708: 1997(F)

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ISO 10708:1997(F)
Sommaire
1
1 Domaine d’application . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Il
2 Référence normative . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .*.*.
3 Définitions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
4 Principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .“. 3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .~.~.~. 3
5 Environnement d’essai
3
6 Réactifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
7 Appareillage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8 Mode opératoire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
9
9 Calcul et expression des résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .~.~. 11
10 Validité de l’essai
.................................................................................................................................................... 11
11 Rapport d’essai
................................................ 13
Annexe A (informative) Calcul de la demande théorique en oxygène (DThO)
..................................... 14
Annexe B (informative) Détermination de la demande chimique en oxygène (DCO)
Annexe C (informative) Correction de la consommation en oxygène pour éliminer l’interférence
15
avec la nitrification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .*.
17
Annexe D (informative) Exemple de courbe de dégradation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
Annexe E (informative) Bibliographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .*.
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
Internet central @ iso.ch
x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
II

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0 ISO
ISO10708:1997(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
L’ISO collabore étroitement avec la Commission
liaison avec I’ISO participent également aux travaux.
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 10708 a été élaborée par le comité technique ISOTTC 147, Qualité de /‘eau, sous-
comité SC 5, Méthodes biologiques.
Les annexes A, B, C, D et E de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d’information.
. . .
Ill

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Page blanche

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NORME INTERNATIONALE @ ISO ISO 10708:1997(F)
- Évaluation en milieu aqueux de la
Qualité de l’eau
biodégradabilité aérobie ultime des composés organiques -
Détermination de la demande biochimique en oxygène en fiole
fermée à deux phases
AVERTISSEMENT - PRÉCAUTIONS DE SÉCURITÉ - Les boues activées et les eaux usées peuvent contenir
des organismes potentiellement pathogènes. II convient donc de prendre des précautions appropriées en
les manipulant. II convient également de manipuler avec précaution les composés d’essai toxiques et ceux
dont on ne connaît pas les propriétés.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale prescrit une méthode pour l’évaluation de la biodégradabilité ultime des
composés organiques, sous l’action de micro-organismes aérobies, notamment les composés peu solubles dans
l’eau, présents à une concentration donnée.
NOTE 1 Les conditions décrites dans la présente Norme internationale ne correspondent pas nécessairement aux conditions
optimales d’obtention du niveau maximal de biodégradation.
La présente méthode est applicable aux composés organiques qui
-
sont solubles dans l’eau ou peu solubles dans l’eau à la concentration utilisée dans les conditions de l’essai;
-
n’adsorbent pas, ou n’ont pas d’effet sur l’électrode à oxygène (voir 8.1.2 et 8.3.4);
-
ne sont pas inhibiteurs vis-à-vis des micro-organismes d’essai à la concentration choisie pour l’essai.
NOTE 2 Concernant les mesures spéciales permettant d’introduire, dans les récipients d’essai, des composés à expérimenter
peu solubles dans l’eau, voir I’ISO 10634.
NOTE 3 Les effets inhibiteurs peuvent être déterminés comme décrit en 8.1.4 et 8.3.1, ou à l’aide de toute autre méthode
permettant de déterminer l’effet inhibiteur d’une substance sur les bactéries (voir par exemple I’ISO 8192).
2 Références normatives
La norme suivante contient des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Au moment de la publication, l’édition indiquée était en
vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente Norme
internationale sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer l’édition la plus récente de la norme indiquée ci-
après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur à un
moment donné.
ISO 10634:1995, Qualité de l’eau - Lignes directrices pour la préparation et le traitement des composés organiques
peu solubles dans l’eau en vue de l’évaluation de leur biodégradabilité en milieu aqueux.

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ISO 10708:1997(F)
3 Définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les définitions suivantes s’appliquent.
31 biodégradation ultime
trksformation totale d’un composé chimique organique par les micro-organismes, en présence d’oxygène, en
dioxyde de carbone, eau, sels minéraux de tout autre élément présent (minéralisation) et nouveaux constituants
cellulaires microbiens (biomasse)
3.2 biodégradation primaire
transformation structurelle d’un composé chimique organique par les micro-organismes, résultant en la perte d’une
propriété spécifique
3.3 demande biochimique en oxygène (DBO)
concentration en masse d’oxygène dissous consommé, dans des conditions définies, lors de l’oxydation biologique
aérobie d’un composé chimique ou d’une matière organique dans l’eau; exprimée ici en milligrammes d’oxygène
consommé par milligramme ou par gramme de composé à expérimenter
3.4 demande théorique en oxygène (DThO)
quantité maximale théorique d’oxygène nécessaire pour oxyder complètement un composé chimique, calculée à
partir de la formule moléculaire; exprimée ici en milligrammes d’oxygène requis par milligramme ou par gramme de
composé à expérimenter
3.5 demande chimique en oxygène (DCO)
concentration en masse d’oxygène, équivalente à la quantité d’oxydant spécifié consommé par un composé
chimique ou une matière organique lorsqu’un échantillon d’eau est traité avec cet oxydant dans les conditions
définies; exprimée ici en milligrammes d’oxygène consommé par milligramme ou par gramme de composé à
expérimenter
3.6 carbone organique dissous (COD)
partie du carbone organique dans l’eau qui ne peut être éliminé par la séparation des phases spécifiée, par
exemple par centrifugation à 40 000 ms-* pendant 15 min, ou par filtration sur membrane d’un diamètre de pores
de 0,2 prn à 0,45 prn
3.7 concentration des matières en suspension dans une boue activée
quantité de matière solide obtenue par filtration ou centrifugation d’un volume connu de boue activée après filtration
ou centrifugation puis séchage à environ 105 “C jusqu’à masse constante
3.8 phase de latente
durée comprise entre le début d’un essai et la fin de l’adaptation et de la sélection des micro-organismes de
dégradation, ainsi que l’augmentation du taux de biodégradation d’un composé chimique ou d’une matière
organique jusqu’à environ 10 % du niveau théorique maximal de biodégradation; exprimée en jours
3.9 niveau maximal de biodégradation
taux maximal de biodégradation d’un composé chimique ou d’une matière organique dans un essai au-delà duquel
aucune biodégradation ne survient plus pendant l’essai; exprimé en pourcentage
3.10 phase de dégradation
durée comprise entre la fin de la phase de latente d’un essai et l’instant où environ 90 % du niveau maximal de
biodégradation est atteint; exprimé en pourcentage
3.11 phase de plateau
durée comprise entre la fin de la phase de biodégradation, lorsque le niveau maximal de biodégradation a été
atteint, et la fin de l’essai

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3.12 préexposition
préincubation d’un inoculum en présence du composé à expérimenter, destinée à accroître l’aptitude de I’inoculum
à dégrader le composé par adaptation et sélection des micro-organismes
3.13 préconditionnement
préincubation d’un inoculum dans les conditions d’essai, mais en l’absence du composé à expérimenter, destinée à
améliorer l’efficacité de l’essai par acclimatation des micro-organismes aux conditions de l’essai
4 Principe
La biodégradation des composés organiques par des micro-organismes aérobies est déterminée dans un milieu
aquatique. Le composé organique constitue la seule source de carbone et d’énergie dans ce milieu. Le milieu
inoculé est agité ou remué dans des fioles fermées, contenant des volumes connus de milieu et d’air, afin d’assurer
un état stable de la répartition de l’oxygène entre les phases liquide et gazeuse. La dégradation est suivie par des
mesurages réguliers de la concentration en oxygène dissous dans la phase aqueuse sur une période pouvant
atteindre 28 jours. La quantité totale d’oxygène consommée dans les fioles d’essai est calculée à- partir de la
différence entre les concentrations en oxygène dissous mesurées dans la fiole d’essai à blanc et dans les fioles
d’essai, divisée par la valeur de saturation de l’oxygène dans des conditions normales, et multipliée par la teneur
totale en oxygène présent à l’origine dans les phases gazeuse et liquide. La biodégradabilité est calculée à partir de
la consommation totale en oxygène, divisée par la demande théorique en oxygène (DThO) ou la demande chimique
en oxygène (DCO), exprimée en pourcentage.
5 Environnement d’essai
L’incubation doit être menée à l’obscurité ou sous lumière diffuse, dans une enceinte maintenue à une température
constante (? 0,5 OC) comprise entre 20 “C et 25 OC.
6 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
6.1 Eau
Eau distillée ou déionisée contenant moins de 2 mg/1 de COD et/ou moins de 10 % de la teneur initiale en carbone
organique introduite par le composé à expérimenter.
6.2 Milieu d’essai
6.2.1 Composition
6.2.1 .l Solution A
Dihydrogénophosphate de potassium anhydre (KH,PO,)
83 g
Monohydrogénophosphate de potassium anhydre (K,HPO,) 21,75 g
Monohydrogénophosphate de sodium dihydraté (Na,HP0,,2H,O)
3w g
Chlorure d’ammonium (NH,CI)
095 g
Eau (6.1) q.s.p. 1 litre
3

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NOTE - La composition correcte du milieu peut être vérifiée en mesurant la valeur du pH. II est recommandé que cette valeur
soit de 7,4.
6.2.1.2 Solution B
Dissoudre 22,5 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO,,-/H,O) dans 1 000 ml d’eau (6.1).
6.2.1.3 Solution C
Dissoudre 27,5 g de chlorure de calcium anhydre (CaC12) dans 1 000 ml d’eau (6.1).
6.2.1.4 Solution D
Dissoudre 0,25 g de chlorure de fer(lll) hexahydraté (FeCI,,GH,O) dans 1 000 ml d’eau (6.1). Préparer cette
solution juste avant l’emploi.
NOTE - Pour éviter d’avoir à préparer cette solution juste avant l’emploi, ajouter une goutte d’acide chlorhydrique concentré
(HCI) ou 0,4 g/l d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
6.2.2 Préparation du milieu d’essai
Pour 1 litre de milieu d’essai, ajouter à environ 500 ml d’eau (6.1):
- 10 ml de la solution A;
- 1 ml de chacune des solutions B à D.
Compléter à 1 000 ml avec de l’eau (6.1).
6.3 Solution d’hydroxyde de sodium
Dissoudre de l’hydroxyde de sodium (NaOH) dans l’eau (6.1) pour obtenir une solution entre 0,l mol/1 et 0,5 mol/l.
6.4 Solution d’acide chlorhydrique
Dissoudre de l’acide chlorhydrique (HCI) dans l’eau (6.1) pour obtenir une solution entre 0,l mol/1 et 0,5 mol/l.
7 Appareillage
S’assurer que la verrerie est totalement propre, et plus particulièrement, qu’elle est exempte de matières
organiques ou toxiques. Utiliser le matériel courant de laboratoire, et ce qui suit.
7.1 Fioles d’incubation, étanches aux gaz, par exemple des fioles à col étroit, de 200 ml à 300 ml de volume,
munies de bouchons appropriés (tels que des bouchons en verre rodé, bouchons à vis ou bouchons en caoutchouc
butyle), protégées de la lumière (par exemple réalisées en verre brun). II est recommandé d’utiliser des bouchons à
pinces.
Marquer chacune des fioles de façon indélébile. Si l’électrode à oxygène utilisée n’a pas d’agitateur incorporé,
équiper chaque fiole d’un agitateur magnétique recouvert de polytétrafluoroéthylène. Présélectionner des fioles d’un
volume type tel que l’écart-type de part et d’autre du volume moyen du lot de fioles soit inférieur à 1 ml, ou mesurer
puis enregistrer les volumes individuels des fioles numérotées avec une exactitude de 1 ml. Graisser
soigneusement les bouchons des fioles avec une graisse silicone neutre afin d’assurer une fermeture correcte tout
en permettant de retirer le bouchon facilement.
7.2 Électrode à oxygène, destinée à mesurer dans la gamme allant de 0 mg/l à 10 mg/l, avec une précision de
0
1 / 0.
4

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L’état stable doit être atteint en 2 min environ. Monter l’électrode, par exemple dans un bouchon inerte s’adaptant
parfaitement dans le col en verre rodé de la fiole d’incubation. Utiliser de préférence des électrodes à agitateur
incorporé.
7.3 Agitateurs magnétiques, à régulation de vitesse, si nécessaire.
Les agitateurs fixés à l’électrode à oxygène doivent être réalisés en un matériau tel qu’aucun des composants des
revêtements plastiques ne vienne contaminer le milieu d’essai et qu’aucune adsorption des composés à
expérimenter ne se produise. Chauffer les récipients d’essai en les agitant et en augmentant la température d’essai
doit être évité.
7.4 Dispositif d’agitation, si nécessaire.
7.5 Bain d’eau, ou tout dispositif garantissant un contrôle exact de la température, à + 0,5 “C dans la gamme
allant de 20 “C à 25 “C.
7.6 pH-mètre.
7.7 Analyseur de carbone organique dissous (COD) (seulement dans les cas spécifiques, voir la note 3 en
8.3.4).
8 Mode opératoire
8.1 Préparation du composé à expérimenter et du composé de référence
_ 8.1 .l Composés à expérimenter solubles dans l’eau
Préparer dans l’eau (6.1) ou dans le milieu d’essai (6.2), une solution mère des composés à expérimenter solubles
dans l’eau. Diluer une quantité suffisante de cette solution dans le milieu d’essai (6.2) afin d’obtenir une
concentration d’essai finale correspondant à 100 mg/l de DThO (voir 8.3.3). Pour le calcul de la DThO, voir
l’annexe A. S’il n’est pas possible de calculer la DThO à partir de la formule, utiliser les analyses élémentaires ou
déterminer la DC0 (voir l’annexe B). II faut être conscient du fait que la détermination de la DC0 des substances
peu solubles dans l’eau peut s’avérer difficile. Lorsque la réduction de la DC0 doit être déterminée, mesurer la
concentration équivalente de l’essai DC0 (en milligrammes par litre) ou la calculer à partir de la solution mère
mesurée.
8.1.2 Composés à expérimenter non solubles dans l‘eau
Broyer les matières solides sèches dans un mortier, les peser sur une plaque de verre puis les placer directement
dans les fioles d’essai. Étaler les substances de type huileux ou paraffineux sur une plaque de verre puis, après
avoir pesé de nouveau, les placer directement dans les fioles d’essai.
Lorsque des dispersions ou des émulsions sont utilisées, disperser le composé à expérimenter dans de l’eau (6.1)
à l’aide d’un traitement par ultrasons, ou l’émulsionner à l’aide d’un émulsifiant non biodégradable, ou bien utiliser
les deux techniques combinées. L’éthoxylate de nonylphénol (environ 10 EO) et le propoxylate (environ 3 à 7 PO)
constituent des émulsifiants adaptés. S’assurer que la dispersion ou l’émulsion est homogène en cas d’utilisation
d’une aliquote pour obtenir la concentration d’essai souhaitée.
S’assurer que la quantité finale de composé à expérimenter dans le récipient d’essai est à environ 100 mg/l de
DThO (voir l’annexe A). II n’est pas nécessaire d’obtenir exactement 100 mg/l, mais noter la quantité exacte pour
chaque fiole numérotée.
Pour toute information complémentaire concernant la manipulation des composés à expérimenter peu solubles
dans l’eau, voir I’ISO 10634.
NOTE - Si le composé à expérimenter (par exemple une substance de type huileux ou
gras) adsorbe sur l’électrode à
oxygène, le mesurage de l’oxygène peut être réduit et les résultats d’essai peuvent être
influencés. Une adsorption peut
5

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également se produire sur les parois du flacon ou sur les bouchons. Si tel est le cas, choisir une autre méthode d’essai [par
exemple l’essai respirométrique (ISO 9408) ou l’essai de dégagement de CO, (ISO 9439)].
8.13 Solution du composé de référence
Préparer une solution mère du composé de référence (un composé organique de biodégradabiiité connue, tel que
l’acétate de sodium, le benzoate de sodium ou I’aniline) de la même façon qu’en 8.1.1, afin d’obtenir une
concentration d’essai finale correspondant à 100 mg/1 de DThO.
8.1.4 Solution de contrôle de l’inhibition
Si l’on souhaite obtenir des informations sur le risque d’inhibition de I’inoculum par le composé à expérimenter,
préparer, dans le milieu d’essai (6.2), une solution contenant le composé à expérimenter et le composé de
référence aux concentrations respectives indiquées en 8.1 .l , 8.1.2 et 8.1.3.
8.2 Préparation de I’inoculum
Préparer I’inoculum à partir des sources décrites en 8.2.1 à 8.2.3 ou d’un mélange de ces sources, afin d’obtenir
une population microbienne offrant une activité de biodégradation suffisante. Stabiliser I’inoculum comme décrit en
8.3.2 avant de l’utiliser dans l’essai.
8.2.1 Inoculum provenant d’un effluent secondaire
Prélever un échantillon provenant d’un effluent secondaire d’une usine de traitement des eaux ou d’un laboratoire
traitant principalement des eaux usées domestiques. Si la densité de micro-organismes dans I’inoculum est si faible
qu’elle ne remplit pas les exigences de volume convenable [voir b)], concentrer l’échantillon par filtration ou
centrifugation. Bien mélanger, conserver l’échantillon dans des conditions aérobies et l’utiliser de préférence le jour
du prélèvement.
À partir de cet échantillon, préparer un inoculum comme suit.
a) Laisser décanter l’échantillon d’effluent pendant 1 h.
Prélever un volume convenable du liquide surnageant afin de l’utiliser comme inoculum; un volume est dit
b)
convenable,
-
s’il permet d’obtenir une population offrant une activité de biodégradation suffisante;
-
s’il assure la dégradation du composé de référence au pourcentage spécifié;
-
s’il fournit entre 104 et lO* cellules actives par millilitre;
-
s’il ne fournit pas, dans le mélange final, plus de l’équivalent de 30 mg/1 de matières solides en suspension
dans les boues activées.
8.2.2 Inoculum provenant d’une usine de traitement des boues activées
Prendre un échantillon de boue activée prélevé dans le réservoir d’aération d’une usine de traitement des eaux ou
d’un laboratoire traitant principalement des eaux usées domestiques. Bien mélanger, conserver l’échantillon dans
des conditions aérobies et l’utiliser de préférence le jour du prélèvement.
Avant l’emploi, déterminer la concentration de matières solides en suspension (utiliser par exemple I’ISO 11923). Si
la concentration de matières en suspension est très faible, concentrer la boue par décantation, de sorte que le
volume de boue ajouté à l’échantillon d’essai soit le plus faible possible. Si de nombreuses particules grossières
sont présentes dans la boue, une séparation est nécessaire. Filtrer la boue à travers un filtre fin et rincer plusieurs
fois à l’aide du milieu d’essai (6.2). Puis centrifuger ou laisser décanter la boue, rejeter la phase liquide et remettre
les matières solides en suspension dans le milieu d’essai afin d’obtenir une concentration de matières solides .
d’environ 3 g/l. Utiliser un volume tel qu’il ne fournit pas plus de 30 mg/1 de matières en suspension dans le mélange
final.
6

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8.2.3 Inoculum provenant d’une eau de surface
Prélever un échantillon d’une eau de surface appropriée. Si la quantité de micro-organismes dans I’inoculum est
trop faible et ne remplit pas les exigences de volume convenable indiquées en 8.2.1, concentrer l’échantillon par
filtration ou centrifugation. Conserver l’échantillon dans des conditions aérobies et l’utiliser de préférence le jour du
prélèvement. Prendre un volume d’inoculum convenable (voir 8.2.1).
NOTE - Dans certaines circonstances, il est admis d’utiliser des inocula préexposés, à condition que cela soit clairement
mentionné dans les résultats d’essai (par exemple, pourcentage de biodégradation = x %, avec inocula préexposés) et que la
méthode de préexposition soit détaillée dans le rapport d’essai. Des inocula préexposés peuvent être obtenus à partir d’essais
de biodégradation en laboratoire effectués dans différentes conditions [par exemple, essai de Zahn-Wellens (ISO 9888) ou
essai SCAS (ISO 9887)] ou à partir d’échantillons prélevés à des emplacements ou sont réunies les conditions
d’environnement appropriées (par exemple usine assurant le traitement de composés identiques ou zones contaminées).
8.3 Mode opératoire d’essai
8.3.1 Préparation des fioles d’essai
Préparer un nombre suffisant de fioles d’incubation (7.1) afin d’obtenir
-
au moins trois fioles contenant le composé à expérimenter (8.1 .l ou 8.1.2) et le milieu d’essai inoculé (6.2 et 8.2)
(fioles FT);
-
au moins trois fioles d’essai à blanc contenant le milieu d’essai inoculé (6.2 et 8.2) (fioles Fg);
-
au moins trois fioles de vérification du mode opératoire, contenant le composé de référence (8.1.3) et le milieu
d’essai inoculé (6.2 et 8.2) (fioles F,);
-
si nécessaire, au moins une fiole destinée à vérifier un éventuel effet inhibiteur du composé à expérimenter,
contenant la solution de 8.1.4 et le milieu d’essai inoculé (6.2 et 8.2) (fiole FI);
-
si nécessaire, au moins une fiole destinée à vérifier une éventuelle élimination abiotique, contenant le composé
à expérimenter (8.1 .l ou 8.1.2), mais sans inoculum, stérilisée par ajout de, par exemple, 1 ml/1 d’une solution
contenant 10 g/l de chlorure mercure (HgCI,), ou de tout autre composé inorganique toxique propre à
empêcher l’activité microbienne (fiole FS). Si des substances très facilement dégradables sont soumises à
l’essai, ajouter la même quantité de substance toxique deux semaines après le début de l’essai.
8.3.2 Stabilisation du milieu inoculé
Préparer un milieu d’essai (6.2) suffisant pour réaliser l’essai complet, l’inoculer et le répartir entre les fioles d’essai.
Si par exemple de la boue activée est utilisée comme inoculum, prendre environ 800 ml du milieu d’essai (6.2),
ajouter 10 ml d’inoculum (8.2.2), puis compléter à 1 000 ml avec le milieu d’essai (6.2). La concentration de
matières solides en suspension ne doit pas excéder 30 mg/l.
Placer un agitateur magnétique dans chaque fiole (si un dispositif d’agitation n’est pas utilisé et/ou si l’électrode à
oxygène n’est pas équipée d’un agitateur incorporé) et ajouter un volume bien mélangé de milieu inoculé,
correspondant aux deux tiers du volume libre de la fiole (par exemple 200 ml de liquide dans des fioles de 300 ml).
Placer les fioles fermées sur le dispositif d’agitation ou les agiter, et incuber entre 20 “C et 25 “C pendant une
semaine. Pendant cette période, les bactéries utiliseront leur matériau de réserve et I’inoculum se stabilisera.
8.3.3 Début de l’essai
Aérer les fioles d’essai contenant le milieu inoculé stabilisé (8.3.2) avec de l’air comprimé saturé en eau et un
diffuseur d’air, pendant environ 15 min. Mesurer la concentration initiale en oxygène, ce qui est recommandé, ou la
calculer (voir 8.3.4). Ajouter aux fioles FT une quantité appropriée de la solution mère du composé à expérimenter
(8.1 .l), ou ajouter directement les substances d’essai peu solubles dans l’eau (8.1.2) afin d’obtenir la concentration
d’essai souhaitée qui est normalement de 100 mg/l de DThO par fiole. Ajouter aux fioles F, une quantité appropriée
de solution mère du composé de référence (8.1.3) et, à la fiole F,, les mêmes quantités de composé à expérimenter
et de composé de référence (8.1.4). Pour la fiole F,, utiliser un milieu d’essai non inoculé (6.2) et ajouter la même
7

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quantité de composé à expérimenter que pour les fioles F,. S’assurer que toutes les fioles contiennent les mêmes
volumes d’eau et d’air (voir 8.3.2); ajouter de l’eau (6.1) si nécessaire.
Boucher toutes les fioles hermétiquement (par exemple à l’aide de bouchons à pinces), les placer sur le dispositif
d’agitation et les incuber à température constante (à + 0,5 “C) entre 20 “C et 25 “C. Au lieu d’utiliser un dispositif
d’agitation, il est possible d’agiter les fioles à l’aide d’un agitateur magnétique.
8.3.4 Analyse
Étalonner avec précision l’électrode à oxygène selon les instructions du fabricant.
II convient d’étalonner le point zéro, la valeur de saturation et la dérive, en plaçant par exemple l’électrode dans une
eau saturée d’air à 20 “C + 0,5 OC. II convient d’ajuster la lecture de la valeur de saturation de l’oxygène dissous
dans l’eau à 9,08 mg/l, valeur théorique à la pression atmosphérique normale (1 013 hPa) et 20 OC. Les valeurs
pour l’oxygène se lisent normalement sur une échelle de 0 mg/l à 10 mg/l, avec une précision de 0,l mg/l. Il n’est
pas nécessaire de corriger les variations de la pression atmosphérique.
NOTE 1 Si le composé à expérimenter est susce
...